[發明專利]一種生產納他霉素的基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201410180186.3
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103923870A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 朱希強;王淼;王紹花;宗工理;劉飛;侯重文;于林艷
• 申請（專利權）人: 山東大學;山東省生物醫藥科學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12P19/62;C12R1/465
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種生產納他霉素的基因工程菌及其構建方法與應用。

背景技術

納他霉素(Natamycin)，又稱為匹馬霉素，是一種26環四烯大環內酯類抗真菌劑，具有天然、廣譜、高效、低毒的特點。這種抗生素不僅可以有效抑制酵母和霉菌的生長，而且可以有效防止絲狀真菌黃曲霉毒素的產生。在醫藥領域，可以廣泛應用于治療由真菌引起的疾病。在食品領域，由于納他霉素的廣譜性及對于哺乳動物的低毒性，1982年被美國FDA批準可以作為一種食品防腐劑使用，并歸類為GRAS(generally?regard?as?safe)產品之列，1997年我國衛生部正式批準納他霉素作為食品防腐劑。目前納他霉素已經在50多個國家被廣泛應用于乳制品、肉制品、發酵酒、飲料等食品的生產和保藏。

隨著納他霉素在醫藥及食品行業的不斷開發，其需求量不斷增加。但由于目前其發酵水平偏低，導致生產成本很高，嚴重制約其在各領域的應用。納他霉素生產菌株的基因組上，負責納他霉素生物合成基因簇含16個ORF(open?reading?frame)。MartaV.Mendes等人實驗證明其中的pimE基因編碼的PimE蛋白可作為納他霉素合成的信號蛋白。該基因的敲除，不僅阻斷了PimE蛋白的合成，同時也無納他霉素的產生；而在敲除該基因的突變體中加入不同來源的PimE蛋白均可不同程度的激發納他霉素的產生。

PimE蛋白即膽固醇氧化酶(cholester?oloxidase,簡稱COD)，是膽固醇降解代謝過程中的第一個酶，能專一性地催化底物膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮。微生物是膽固醇氧化酶最為主要的來源。國內外學者對微生物來源的膽固醇氧化酶的特性、結構、應用和基因克隆等方面進行了廣泛研究，取得了較大進展。膽固醇氧化酶最早用于動物血清中膽固醇含量的檢測，近年來發現它在生化制藥、食品加工、抗蟲基因工程等方面也具有良好的應用價值，而其在提高多烯大環內酯類抗真菌劑生物產量方面的應用還未見文獻報道。

中國專利CN103555755A公開了一種利用vgb基因構建的抗貧氧高密度發酵納他霉素基因工程菌株及其應用,該發明提供了一種利用vgb基因構建的抗貧氧高密度發酵納他霉素的基因工程菌株，其利用透明顫菌血紅蛋白基因vgb構建重組質粒，通過接合轉移的方式將vgb基因整合入褐黃孢鏈霉菌基因組中，獲得可直接用于納他霉素發酵生產的重組基因工程菌株，重組菌中VHb的表達可有效解決納他霉素發酵生產中的氧供求矛盾，大幅度提高納他霉素的產量，降低生產成本，帶來巨大的經濟效益,該專利是從解決納他霉素發酵生產中的氧供求矛盾出發，構建工程菌提高納他霉素產量。

發明內容

本發明的目的是提供一種生產納他霉素的基因工程菌及其構建方法與應用。

一種生產納他霉素的基因工程菌，菌株名為swjs-801，分類命名為褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces?gilvosporeus)，保藏號為CGMCC?No.8901，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2014年03月07日。

本發明的基因工程菌，含有兩個拷貝pimE基因。

本發明所提供的基因工程菌的構建方法，包括以下步驟：擴增pimE基因及紅霉素抗性基因啟動子(Pemr*)；融合片段Pemr*-pimE，將Pemr*-pimE基因片段插入載體，構建重組質粒；利用接合轉移的方式轉化褐黃孢鏈霉菌，抗生素篩選獲得含有兩個拷貝pimE基因的重組工程菌，通過搖瓶發酵實驗篩選納他霉素產量最高的重組菌進行保藏。

所述啟動子為紅霉素抗性基因(Emr)強啟動子。

所述的重組質粒為pSET152-pimE，重組質粒還包括構建重組質粒pSET152-pimE過程中的pMG36e和pSET152載體，其中pMG36e含有Emr基因啟動子序列，pSET152含有質粒轉移所需元件及噬菌體的整合酶和整合位點，重組質粒pSET152-pimE是融合片段Pemr*-pimE經單酶切后連接入pSET152質粒中構建而成。

所述接合轉移的步驟具體為將重組質粒導入大腸桿菌ET12567(pUZ8002)中，將重組大腸桿菌與褐黃孢鏈霉菌共培養于MS(優選含10mM?MgCl₂)固體培養基上，30℃培養16-20h，然后涂布1mL無菌水(優選含0.5mg萘啶酮酸和1mg安普霉素)覆蓋平板，30℃恒溫培養至長出轉化子。