[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)納他霉素的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410180186.3
• 申請日: 2014-04-30
• 公開（公告）號: CN103923870A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱希強;王淼;王紹花;宗工理;劉飛;侯重文;于林艷
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學;山東省生物醫(yī)藥科學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12P19/62;C12R1/465
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.一種生產(chǎn)納他霉素的基因工程菌，其特征在于，分類命名為褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces?gilvosporeus)，已于2014年03月07日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC?No.8901。

2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有兩個拷貝pimE基因。

3.如權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：擴增pimE基因及Emr基因啟動子；融合片段Pemr*-pimE，將Pemr*-pimE基因片段插入載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒；利用接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)化褐黃孢鏈霉菌，安普霉素篩選獲得含有兩個拷貝pimE基因的重組工程菌，通過搖瓶發(fā)酵實驗篩選獲得高產(chǎn)納他霉素的重組菌。

4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述啟動子為紅霉素抗性基因強啟動子。

5.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的重組質(zhì)粒為pSET152-pimE。

6.如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒還包括pMG36e載體和pSET152載體，其中pMG36e載體含有Emr基因啟動子序列，pSET152載體含有質(zhì)粒轉(zhuǎn)移所需元件及噬菌體φ31的整合酶和整合位點。

7.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述接合轉(zhuǎn)移的步驟具體為：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567中，將重組大腸桿菌與褐黃孢鏈霉菌共培養(yǎng)于MS固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)16-20h，然后涂布1mL無菌水覆蓋平板，30℃恒溫培養(yǎng)至長出轉(zhuǎn)化子，所述MS固體培養(yǎng)基中含10mM?MgCl₂，所述無菌水中含0.5mg萘啶酮酸和1mg安普霉素。

8.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的搖瓶發(fā)酵實驗條件為29℃，轉(zhuǎn)速為200～250rpm，發(fā)酵96～120h。

9.權(quán)利要求1或2所述工程菌在制備納他霉素中的應(yīng)用。