[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410177616.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103966258A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐茜;周偉軍;劉宏波;李蘭;黃昌蓉;許玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 鄭紅莉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種以油菜下胚軸為外植體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，屬于植物組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

油菜是一種重要的油料作物，廣泛種植于中國(guó)、印度、加拿大和歐洲等地，且在全球油料作物產(chǎn)量中排名第三。1974年Kartha等人首次從油菜的莖切段誘導(dǎo)培養(yǎng)出小植株。此后，人們依據(jù)細(xì)胞全能性原理，利用油菜的不同外植體類型誘導(dǎo)出愈傷組織，并獲得再生植株，如油菜的莖、子葉、葉片、小孢子、莖尖、下胚軸、根和原生質(zhì)體等。油菜再生體系的建立是其遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，油菜外植體的再生頻率降低，將造成其遺傳轉(zhuǎn)化效率的降低，因此建立一個(gè)高效的油菜再生體系是保證轉(zhuǎn)基因油菜遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。

有研究表明，油菜植株的高效再生與外植體的類型有著密切關(guān)系，不同油菜外植體的再生頻率及轉(zhuǎn)化效率不相同。其中利用無(wú)菌苗下胚軸作為起始外植體建立的再生體系，與其他外植體類型相比，具有再生周期短、再生能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高，分化芽質(zhì)量好、易被農(nóng)桿菌感染和轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，因此下胚軸成為油菜再生和轉(zhuǎn)化體系的首選外植體類型。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，油菜下胚軸的分化存在極性，再生頻率、轉(zhuǎn)化效率與下胚軸的部位有關(guān)。在目前已公開(kāi)的油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，大部分研究只考慮使用下胚軸作為外植體，很少研究下胚軸的分化極性對(duì)其再生頻率和轉(zhuǎn)化效率的影響。此外，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化受諸多因素的影響，在共培養(yǎng)階段農(nóng)桿菌Vir區(qū)控制著帶有目的基因T-DNA的轉(zhuǎn)移，除了酚類化合物能夠活化Vir區(qū)基因，pH值對(duì)Vir區(qū)基因也有明顯的誘導(dǎo)作用。合適的共培養(yǎng)基pH值有利于提高抗性芽苗分化率，促進(jìn)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。

目前的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)普遍存在抗性苗分化率低，目的基因轉(zhuǎn)化效率差的現(xiàn)狀，如何能夠建立高效地轉(zhuǎn)化體系，提高抗性苗的分化率，是油菜轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)重要研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，建立完整的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗草甘膦甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高再生體系的分化效率。

一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

(1)取甘藍(lán)型油菜幼苗的下胚軸，以下胚軸的下端為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；

所述下胚軸的下端為下胚軸靠近胚根的長(zhǎng)0.5～1cm的部分；所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH為5.8；

(2)利用攜帶抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體，然后進(jìn)行共培養(yǎng)；

所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH在5.0～5.4之間；

(3)將共培養(yǎng)后的外植體，在含低濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基I上篩選培養(yǎng)10天，再接種到含高濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基II上，誘導(dǎo)生成抗性不定芽；

所述分化培養(yǎng)基I為：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/L AgNO₃+250mg/L Tim+4.5mg/L草甘膦，pH為5.8；

所述分化培養(yǎng)基II為：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/L Tim+9.0mg/L草甘膦，pH為5.8；

(4)進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得抗性苗。

所述甘藍(lán)型油菜幼苗的培養(yǎng)方法包括：將油菜種子消毒后平鋪在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)直至獲得幼苗，所述同體培養(yǎng)基為：1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L瓊脂，pH為5.8。

所述農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體包括：制備侵染液，將愈傷化的外植體浸入侵染液中，取出后吹干。

所述愈傷化的外植體浸入侵染液的時(shí)間為3～10分鐘。

所述侵染液制備方法包括：

(1)農(nóng)桿菌的活化；

(2)將活化后的農(nóng)桿菌接入液體培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)液OD₆₀₀值達(dá)到0.8～1時(shí)，分離獲得農(nóng)桿菌；

(3)將分離得到的農(nóng)桿菌混入1/5MS+15g/L蔗糖的培養(yǎng)液中，懸浮制得侵染液。

所述液體培養(yǎng)基為：YEB+12mg/L四環(huán)素+50mg/L卡那霉素。

所述生根培養(yǎng)包括：當(dāng)抗性不定芽長(zhǎng)至3～5cm時(shí)，從基部切去愈傷組織，將抗性不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中。

所述生根培養(yǎng)基為：MS+0.2mg/L NAA+4.5mg/L草甘膦，pH為5.8。