[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410177616.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103966258A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐茜;周偉軍;劉宏波;李蘭;黃昌蓉;許玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 鄭紅莉

1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取甘藍(lán)型油菜幼苗的下胚軸，以下胚軸的下端為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；

所述下胚軸的下端為下胚軸靠近胚根的長(zhǎng)0.5～1cm的部分；所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH為5.8；

(2)利用攜帶抗草甘膦基因的農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體，然后進(jìn)行共培養(yǎng)；

所述共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+2.5mg/L2.4-D+18.0g/L蔗糖，pH在5.0～5.4之間；

(3)將共培養(yǎng)后的外植體，在含低濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基I上篩選培養(yǎng)10天，再接種到含高濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基II上，誘導(dǎo)生成抗性不定芽；

所述分化培養(yǎng)基I為：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/L Tim+4.5mg/L草甘膦，pH為5.8；

所述分化培養(yǎng)基II為：MS+3.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3.0mg/LAgNO₃+250mg/L Tim+9.0mg/L草甘膦，pH為5.8；

(4)進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得抗性苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述甘藍(lán)型油菜幼苗的培養(yǎng)方法包括：將油菜種子消毒后平鋪在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)直至獲得幼苗，所述固體培養(yǎng)基為：1/2MS+18.0g/L蔗糖+9.0g/L瓊脂，pH為5.8。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌侵染愈傷化的外植體包括：制備侵染液，將愈傷化的外植體浸入侵染液中，取出后吹干。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述愈傷化的外植體浸入侵染液的時(shí)間為3～10分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述侵染液制備方法包括：

(1)農(nóng)桿菌的活化；

(2)將活化后的農(nóng)桿菌接入液體培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)液OD₆₀₀值達(dá)到0.8～1時(shí)，分離獲得農(nóng)桿菌；

(3)將分離得到的農(nóng)桿菌混入1/5MS+15g/L蔗糖的培養(yǎng)液中，懸浮制得侵染液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基為：YEB+12mg/L四環(huán)素+50mg/L卡那霉素。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)包括：當(dāng)抗性不定芽長(zhǎng)至3～5cm時(shí)，從基部切去愈傷組織，將抗性不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)基為：MS+0.2mg/L NAA+4.5mg/L草甘膦，pH為5.8。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，還包括：當(dāng)抗性苗形成完整根系后，開(kāi)瓶煉苗一天，取出抗性苗移入1/5MS培養(yǎng)液中，水培1周后，移栽到有機(jī)質(zhì)培養(yǎng)土中。