[發明專利]實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201410177428.3
• 申請日: 2014-04-29
• 公開（公告）號: CN103923941A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 夏慶友;王峰;徐漢福;王元成;王日遠;趙萍
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于基因工程領域，特別涉及一種實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體實現轉基因穩定性的piggyBac載體，還涉及該載體的制備方法。

背景技術

來源于粉紋夜蛾的piggyBac轉座子是迄今為止應用最為廣泛的轉基因載體之一，它在包括哺乳動物、昆蟲、原生動物以及渦蟲等三十余個不同物種或生殖種系中取得了轉基因的成功。piggyBac是典型的Ⅱ型轉座子家族成員，在其內部區域序列(internal?region)編碼的轉座酶(transposase)的協助下，它通過其兩端的末端反向重復序列(ITRs)，在“TTAA”特征靶序列處發生轉座插入。轉基因即是通過將外源基因序列替換掉piggyBac內部編碼轉座酶的序列，并由瞬時表達轉座酶的方式來實現。隨著瞬時表達的轉座酶的消失，攜帶有轉基因序列的piggyBac不會再次發生轉座。這種模式對于轉基因的建立和持續表達十分重要。雖然受未知因素影響，比如內源性的轉座酶，或者外部提供的轉座酶而導致piggyBac攜帶的轉基因發生再次轉座的事件不會對基礎研究產生太大影響。但是，piggyBac的長期穩定性對于那些有望應用到實際生產上去的轉基因品系卻尤其重要。

家蠶不僅是重要的經濟產絲昆蟲，為農業經濟做出卓越貢獻。同時家蠶也是公認的鱗翅目昆蟲模式生物代表，推動了生命科學的發展。隨著家蠶基因組的解析，對家蠶的研究已經進入功能基因組時代。自從2000年Tamura等人報告piggyBac的轉基因技術在家蠶中成功應用的案例后，該技術被廣泛的應用到家蠶的基礎與應用研究中。許多家蠶的功能基因通過該技術得以詳細的詮釋。更為重要的是，該技術也成為家蠶遺傳改良的有力工具，被廣泛的用于蠶絲力學性能改良、轉基因家蠶生物反應器以及轉基因家蠶抗性素材培育等應用研究中，并取得巨大進展。隨著piggyBac技術在家蠶中的廣泛使用，越來越多的跟實際應用緊密相關的轉基因家蠶正被逐步的推向實用化，并且Xu等人曾報道過家蠶基因中存在許多piggyBac-like的轉座子元件，并且推測相當一部分還具有轉座活性。因此對家蠶轉基因的piggyBac載體進行改進以提高轉基因在家蠶基因組中的長期穩定顯得尤為重要。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體，提高轉基因在家蠶基因組中的長期穩定性；本發明的目的之二在于提供該載體的制備方法，其制備方法簡單。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

1、實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體，所述piggyBac載體含有3個末端反向重復序列，位于中間位置的末端反向重復序列小于679bp且與左側末端反向重復序列的方向相同。

優選的，所述位于中間位置的末端反向重復序列為193bp。

優選的，所述位于中間位置的末端反向重復序列的序列如SEQ?ID?NO.5所示。

更優選的，所述piggyBac載體依次包括左側反向重復序列，外源基因表達框Ⅰ、位于中間位置的末端反向重復序列、外源基因表達框Ⅱ和右側末端反向重復序列。

優選的，所述外源基因表達框Ⅰ與位于中間位置的末端反向重復序列之間還包括限制性酶切位點。

優選的，所述限制性酶切位點為AscI限制性酶切位點。

更優選的，所述piggyBac載體的序列如SEQ?ID?NO.7所示。

2、所述實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體的制備方法，包括如下步驟：以pBac[3xp3-EGFPaf]載體為模板，設計擴增左側反向重復序列的引物，然后進行PCR擴增，然后將擴增產物通過MluI和AscI酶切，酶切后插入到pBac[3xp3-EGFPaf]載體的AscI位點，篩選插入方向與pBac[3xp3-EGFPaf]載體的左側反向重復序列同向的載體，得實現家蠶轉基因長期穩定性的piggyBac載體。

優選的，所述擴增左側反向重復序列的引物如SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。