[發(fā)明專利]前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410176073.6
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN104152398A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江明;李鐵軍;彭薇;張平靜
• 申請（專利權(quán)）人: 百奧邁科生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩;王婧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和細胞生物學(xué)以及組織工程領(lǐng)域，具體涉及小鼠前列腺原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞分離和建立的新方法。

背景技術(shù)

上皮細胞-間質(zhì)細胞的交互作用(interaction)和相互轉(zhuǎn)換(transition)等生物學(xué)特性在胚胎發(fā)育過程中具有十分重要的地位。諸多研究數(shù)據(jù)表明這些生物學(xué)過程在調(diào)控正常人體組織和腫瘤組織的細胞可塑性方面也起到了關(guān)鍵作用。通過上皮細胞-間質(zhì)細胞的交互作用和轉(zhuǎn)換過程能夠形成多個各不相同的細胞亞群，即形成了腫瘤細胞異質(zhì)性。這些亞群細胞都具有各自的特點，有一些可能分化程度較高，但還有一些則表現(xiàn)出了干細胞的特征。而這些特征又都與腫瘤相關(guān)表型，比如腫瘤轉(zhuǎn)移、抗藥性或致死率等有關(guān)，因此，如何針對腫瘤細胞的這種干細胞特征(即可塑性)來設(shè)計治療方案和尋找新的治療藥物已經(jīng)成為臨床研究的關(guān)注點。

建立同一組織來源中上皮細胞和間質(zhì)細胞原代培養(yǎng)的方法可以更好地研究上皮細胞和間質(zhì)細胞的組成和各自的功能，以及研究小鼠前列腺組織上皮細胞-間質(zhì)細胞之間的交互作用和相互轉(zhuǎn)換過程以及與基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)系，同時研究前列腺組織發(fā)育、再生和修復(fù)的分子機制，為疾病和腫瘤的靶向基因治療藥物開發(fā)提供更好的體外研究模型。

目前研究報道的原代細胞制備方法步驟繁瑣、程序復(fù)雜、成本高，不易分離上皮細胞與間質(zhì)細胞。

本發(fā)明提供了一種從同一個正常成年小鼠前列腺組織同時分離和建立原代上皮細胞和間質(zhì)細胞的新方法，簡便易行、重復(fù)性好、成本低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡便易行、重復(fù)性好、成本低的從同一個正常成年小鼠前列腺組織同時分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，具體步驟包括：

第一步：將小鼠前列腺葉組織剪碎，用原代細胞培養(yǎng)液洗滌，將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到離心管中，并離心；

第二步：用原代細胞培養(yǎng)液重懸組織并轉(zhuǎn)移到T-25培養(yǎng)瓶中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，當(dāng)組織塊粘附在瓶底之后，倒出培養(yǎng)液并重新加入原代細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3天后，小鼠前列腺上皮和間質(zhì)細胞從組織塊周圍生長出(out-growth)

第三步：用胰酶充分消化生長出的細胞，離心收集細胞并將其轉(zhuǎn)移至另一新的含原代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，得到小鼠前列腺組織原代上皮細胞和間質(zhì)細胞：或者，在倒置顯微鏡下辨別各種細胞和組織塊的類型，用細胞刮刀將間質(zhì)細胞和組織塊刮掉或?qū)⑸掀ぜ毎徒M織塊刮掉，用原代培養(yǎng)基洗滌后，用胰酶充分消化生長出的細胞，離心收集細胞并將其轉(zhuǎn)移至另一新的含原代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，得到小鼠前列腺組織原代上皮細胞或間質(zhì)細胞。

優(yōu)選地，所述的原代細胞培養(yǎng)液通過在RPMI1640培養(yǎng)基中加入FBS和抗菌-抗真菌劑得到。

優(yōu)選地，所述的第三步還包括：繼續(xù)培養(yǎng)細胞并傳代15-25次，改換常規(guī)細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，實現(xiàn)細胞永生化，所述的常規(guī)細胞培養(yǎng)液通過在RPMI1640培養(yǎng)基中加入FBS和抗菌素得到，F(xiàn)BS和抗菌素的終濃度分別為5％和1％。

優(yōu)選地，所述的第三步還包括：凍存并復(fù)蘇細胞，在與第二步相同的培養(yǎng)條件下重新生長后進行鑒定。

更優(yōu)選地，所述的前列腺原代上皮細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)(IHC)染色顯示干祖細胞標(biāo)記物CD-133、CD-44和LDH為強陽性，分泌細胞標(biāo)記物細胞角蛋白CK-8、CK-18和AR為弱陽性，顯示為基底細胞(干、祖細胞)類型為主的混合型。

更優(yōu)選地，所述的前列腺原代上皮細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示基底細胞標(biāo)記物細胞角蛋白CK-5和細胞角蛋白CK-14為強陽性，分泌細胞標(biāo)記物細胞角蛋白CK-8和CK-18為弱陽性，顯示為基底細胞類型為主的混合型。

更優(yōu)選地，所述的前列腺原代間質(zhì)細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示纖維母細胞標(biāo)記物波形蛋白(vimentin)強陽性，平滑肌細胞標(biāo)記物平滑肌α-肌動蛋白(α-SM-actin)弱陽性，顯示為纖維母細胞類型為主的混合型。

優(yōu)選地，所述的小鼠前列腺組織原代上皮細胞包括干祖細胞、基底細胞和分泌細胞。

優(yōu)選地，所述的小鼠前列腺組織原代間質(zhì)細胞包括纖維母細胞和平滑肌細胞。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：