[發(fā)明專利]前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410176073.6
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN104152398A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江明;李鐵軍;彭薇;張平靜
• 申請（專利權(quán)）人: 百奧邁科生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩;王婧

1.一種前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，具體步驟包括：

第一步：將小鼠前列腺葉組織剪碎，用原代細胞培養(yǎng)液洗滌，將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到離心管中，并離心；

第二步：用原代細胞培養(yǎng)液重懸組織并轉(zhuǎn)移到T-25培養(yǎng)瓶中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，當(dāng)組織塊粘附在瓶底之后，倒出培養(yǎng)液并重新加入原代細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3天后，小鼠前列腺上皮和間質(zhì)細胞從組織塊周圍生長出：

第三步：用胰酶充分消化生長出的細胞，離心收集細胞并將其轉(zhuǎn)移至另一新的含原代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，得到小鼠前列腺組織原代上皮細胞和間質(zhì)細胞；或者，在倒置顯微鏡下辨別各種細胞和組織塊的類型，用細胞刮刀將間質(zhì)細胞和組織塊刮掉或?qū)⑸掀ぜ毎徒M織塊刮掉，用原代培養(yǎng)基洗滌后，用胰酶充分消化生長出的細胞，離心收集細胞并將其轉(zhuǎn)移至另一新的含原代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，得到小鼠前列腺組織原代上皮細胞或間質(zhì)細胞。

2.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述的原代細胞培養(yǎng)液通過在RPMI1640培養(yǎng)基中加入FBS和抗菌-抗真菌劑得到。

3.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述的第三步還包括：繼續(xù)培養(yǎng)細胞并傳代15-25次，改換常規(guī)細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，實現(xiàn)細胞永生化，所述的常規(guī)細胞培養(yǎng)液通過在RPMI1640培養(yǎng)基中加入FBS和抗菌素得到，F(xiàn)BS和抗菌素的終濃度分別為5％和1％。

4.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述的第三步還包括：凍存并復(fù)蘇細胞，在與第二步相同的培養(yǎng)條件下重新生長后進行鑒定。

5.如權(quán)利要求4所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代上皮細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示干祖細胞標(biāo)記物CD-133、CD-44和LDH為強陽性，分泌細胞標(biāo)記物細胞角蛋白CK-8、CK-18和AR為弱陽性，顯示為基底細胞類型為主的混合型。

6.如權(quán)利要求4所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代上皮細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示基底細胞標(biāo)記物細胞角蛋白CK-5和細胞角蛋白CK-14為強陽性，分泌細胞標(biāo)記物細胞角蛋白CK-8和CK-18為弱陽性，顯示為基底細胞類型為主的混合型。

7.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細胞和/或間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代間質(zhì)細胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示纖維母細胞標(biāo)記物波形蛋白強陽性，平滑肌細胞標(biāo)記物平滑肌α-肌動蛋白弱陽性，顯示為纖維母細胞類型為主的混合型。