[發(fā)明專利]前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410176073.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN104152398A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江明;李鐵軍;彭薇;張平靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 百奧邁科生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩;王婧

1.一種前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，具體步驟包括：

第一步：將小鼠前列腺葉組織剪碎，用原代細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌，將剪碎的組織轉(zhuǎn)移到離心管中，并離心；

第二步：用原代細(xì)胞培養(yǎng)液重懸組織并轉(zhuǎn)移到T-25培養(yǎng)瓶中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，當(dāng)組織塊粘附在瓶底之后，倒出培養(yǎng)液并重新加入原代細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，2～3天后，小鼠前列腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞從組織塊周圍生長(zhǎng)出：

第三步：用胰酶充分消化生長(zhǎng)出的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至另一新的含原代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，得到小鼠前列腺組織原代上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞；或者，在倒置顯微鏡下辨別各種細(xì)胞和組織塊的類型，用細(xì)胞刮刀將間質(zhì)細(xì)胞和組織塊刮掉或?qū)⑸掀ぜ?xì)胞和組織塊刮掉，用原代培養(yǎng)基洗滌后，用胰酶充分消化生長(zhǎng)出的細(xì)胞，離心收集細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至另一新的含原代培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，得到小鼠前列腺組織原代上皮細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞。

2.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的原代細(xì)胞培養(yǎng)液通過在RPMI1640培養(yǎng)基中加入FBS和抗菌-抗真菌劑得到。

3.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的第三步還包括：繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞并傳代15-25次，改換常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化，所述的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液通過在RPMI1640培養(yǎng)基中加入FBS和抗菌素得到，F(xiàn)BS和抗菌素的終濃度分別為5％和1％。

4.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的第三步還包括：凍存并復(fù)蘇細(xì)胞，在與第二步相同的培養(yǎng)條件下重新生長(zhǎng)后進(jìn)行鑒定。

5.如權(quán)利要求4所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代上皮細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示干祖細(xì)胞標(biāo)記物CD-133、CD-44和LDH為強(qiáng)陽性，分泌細(xì)胞標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白CK-8、CK-18和AR為弱陽性，顯示為基底細(xì)胞類型為主的混合型。

6.如權(quán)利要求4所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代上皮細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示基底細(xì)胞標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白CK-5和細(xì)胞角蛋白CK-14為強(qiáng)陽性，分泌細(xì)胞標(biāo)記物細(xì)胞角蛋白CK-8和CK-18為弱陽性，顯示為基底細(xì)胞類型為主的混合型。

7.如權(quán)利要求1所述的前列腺組織分離和建立原代上皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的前列腺原代間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色顯示纖維母細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白強(qiáng)陽性，平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物平滑肌α-肌動(dòng)蛋白弱陽性，顯示為纖維母細(xì)胞類型為主的混合型。