[發明專利]通過離體挽救培養獲得草莓遠緣雜種的方法及培養基

有效

• 申請號: 201410175221.2
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN105010123B
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 高清華;殷麗青;段可;葉正文;鄭宏清;張麗勍
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H4/00
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司31114
• 代理人: 費開逵,李蘭英

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種通過離體挽救培養獲得草莓遠緣雜種的方法及培養基。

背景技術

草莓屬于薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生草本果樹，在世界小漿果生產中居于首位，絕大部分國家均有栽培。種質資源是育種的物質基礎,近代作物育種所取得的巨大成就主要得益于一批重要種質的發現和利用,以及育種技術的創新和應用。種質資源的收集、發掘和利用越來越受到各國政府和育種家的高度重視。一方面,由于人們對種質資源的重視,存在于植物本身的有利基因及性狀越來越多地被發現,對其利用的速度也在加快。另一方面,種質資源的概念已經拓展,其研究利用的趨勢是擴大親緣距離進行遠緣或超遠緣雜交育種。

中國是世界上野生草莓資源種類最豐富的國家，全世界草莓屬植物約有20個種，在我國自然分布的野生草莓有11個種，約占世界草莓資源的一半以上。野生草莓具有廣泛的適應性和多種優良性狀,是品種改良的重要親本。在野生草莓中存在著大量可利用的優良性狀,如抗病、抗逆、果實品質(大果、香味、硬肉等)、光周期(四季結果和日中性)、直立性及可觀賞性等,將其導入草莓栽培種對草莓種質創新和品種改良極為重要。我國分布的野生草莓資源多為倍性較低的2x、4x和5x,在與8x栽培草莓雜交時常出現不親和或雜種不育等現象。中國在野生草莓的遠緣雜交利用方面已經取得了重要進展,主要利用栽培種鳳梨草莓與野生草莓常規雜交，通過染色體加倍獲得了一批多倍性中間育種材料。但染色體加倍技術復雜，成本較高，果實發育遲緩，結實率偏低，不易獲得目標性狀材料，育種年限長。

遠緣雜交是利用外源基因獲得優良種質的一條很好途徑,但雜交常常會碰到很多障礙,其中胚胎發育中途夭折就是其一,即遠緣雜交授粉、受精成功,受精卵也可分裂,早期胚胎可以發育,但胚胎發育到一定時間就停止、死亡。通過離體胚挽救技術在胚敗育前,取雜種胚培養可以克服這種障礙。胚挽救技術是育種研究中克服胚敗育或發育不良,提高萌發率以及提早萌發,縮短童期、培育遠緣雜交優良種質的有效手段。Wang D等人報道了草莓幼胚培養的研究，但主要是針對幼胚培養的影響因素進行了研究，并未研究在育種技術中的具體應用(HortScience，1984，19：71-72)。由于遠緣雜交育種過程中選擇的親本來源和遺傳背景不同，在對未成熟胚進行離體培養過程中胚誘導、胚萌發、增殖、生根、成苗等狀況會存在差異性，目前利用草莓的未成熟胚進行離體培養在遠緣雜交育種中的成功應用尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過離體挽救培養獲得草莓遠緣雜種的方法及培養基，采用離體胚挽救技術，將野生品種和栽培品種進行遠緣雜交獲得的幼胚取出并進行離體培養,使其在離體條件下發育成為正常植株，能夠獲得豐富的中間性育種材料,可以縮短育種年限,節約人力物力,較快地獲得優良種質。

為了達到以上目的，本發明的技術方案如下：

通過離體挽救培養獲得草莓遠緣雜種的方法，包括以下步驟：

1)雜交授粉：以栽培草莓品種和野生草莓品種為雜交親本進行雜交授粉；

2)果實消毒：將授粉后5～35天的果實取下，4℃～7℃存放3～4小時，選取大小為1～3厘米的果實，先用70％的酒精表面消毒10秒，再在0.1wt％的升汞溶液中滅菌1～3分鐘，用無菌水清洗3～5遍，吸干表面水分；

3)未成熟胚剝離：在無菌條件下，將滅菌的果實取下種子剝離其幼胚，立即接種于誘導培養基中離體培養，先暗培養7天，再進行光照培養，誘導培養21～28天后獲得膨大的胚；

光照培養條件為：光照時間10小時/天，光照強度2000～3000Lx，培養溫度24±1℃；

誘導培養基：1/2MS基本培養基，蔗糖30～50g/L，瓊脂6～8g/L，吲哚丁酸IBA 0.3～0.5mg/L，pH5.5～5.8；

4).胚萌發培養：將膨大的胚剝除胚乳后置于胚萌發培養基中進行挽救培養，培養30～35天后幼胚萌發，光照培養條件同步驟3)；

胚萌發培養基：1/2MS基本培養基，蔗糖30～50g/L，瓊脂6～8g/L，萘乙酸NAA 0.2～0.5mg/L，6-芐氨基腺嘌呤6-BA 1.2～1.5mg/L，pH5.5～5.8；

5)增殖培養：將萌發的幼胚接種至增殖培養基中，光照培養條件與培養基組成同步驟4)，每10-15天繼代增殖1次，獲得芽苗；

6).生根培養：將經過1～4次繼代增殖培養的芽苗從芽叢中切下，轉到生根培養基中促使其生根，生根培養45～60天，得到生根的草莓胚苗，培養溫度24±1℃；