[發(fā)明專利]基于M13噬菌體檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410174931.3
• 申請日: 2014-04-29
• 公開（公告）號: CN103969444A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設計）人: 胡驍飛;張改平;邢廣旭;王耀;王方雨;趙東;鄧瑞廣
• 申請（專利權）人: 河南省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/558
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

技術領域

本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙，特別是涉及一種以展示有OTA模擬表位的M13噬菌體作為檢測印記，用于快速檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及其制備方法。

背景技術

赭曲霉毒素（Ochratoxin）是曲霉屬和青霉屬的某些菌株產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，它包含七種結構類似的化合物，其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)作物污染最重、與人類健康關系最密切的是赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA），其作用的靶器官主要是腎臟和肝臟，是一種強烈的腎、肝毒素，并具有較強的致癌、致畸和致突變作用。由于OTA廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品及畜產(chǎn)品，且能經(jīng)食物鏈進入人體，對人類生命健康造成危害，因此，如何實現(xiàn)對OTA的快速、準確檢測意義重大。

目前，對OTA檢測方法有化學分析法、儀器分析法和免疫學分析法等。其中免疫學分析法以敏感度高、檢出限低的優(yōu)勢在OTA定性、定量檢測中廣泛應用，實現(xiàn)了OTA快速、簡便、高靈敏檢測，對保障我國農(nóng)產(chǎn)品安全有著積極意義。但是，免疫學檢測方法是建立在以標記毒素或偶聯(lián)毒素為競爭抗原基礎上的有毒檢測體系，存在毒素標品昂貴，對生產(chǎn)及操作人員的健康有害，以及偶聯(lián)反應重復性差等缺陷，制約了它的應用和推廣。

近年來，利用噬菌體隨機肽庫技術得到的模擬表位肽替代毒素作為競爭抗原，建立的無毒檢測體系，推動了OTA免疫學檢測的快速發(fā)展。噬菌體隨機肽庫技術是以大量隨機編碼的多肽序列插入噬菌體展示載體，形成噬菌體展示文庫。每個噬菌體粒子或者噬菌體只展示一種序列的外源肽鏈，不同的噬菌體粒子或者噬菌體展示不同序列的外源肽鏈。

免疫試紙法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測物的初步信息，該法靈敏度高，分析過程簡單，用作OTA的檢測有獨特優(yōu)勢，是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測技術。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題：針對現(xiàn)有技術存在的不足，提供一種安全、特異、靈敏、簡便、快速檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及其制備方法。

本發(fā)明的技術方案：

一種基于M13噬菌體檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙，包括底層的支撐層、中間層的吸附層和固定在吸附層上的保護層，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有用展示OTA模擬表位的M13噬菌體印制的隱形檢測印跡，還設有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡；所述金標抗體纖維層采用吸附金標抗體的玻璃纖維棉制成，金標抗體采用膠體金納米顆粒標記的OTA的單克隆抗體或多克隆抗體。

所述OTA模擬表位的多肽序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。

所述M13噬菌體由以下方法篩選，具體步驟為：

（1）親和篩選M13噬菌體隨機七肽庫

取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，每孔加入稀釋后的噬菌體肽庫100μL，其中含噬菌體1×10¹¹~2×10¹¹pfu，室溫下輕搖震蕩1h，棄去液體；沉淀用TBST溶液洗滌10次，洗去未結合的噬菌體后，每孔加入100μL pH2.2的洗脫液Gly-HCl，室溫下輕搖震蕩8min，吸出洗脫液，加入中和緩沖液至中性；中和后的洗脫液除留一部分作滴度測定外，其余的洗脫液接種處于對數(shù)生長前期的E. coli ER2738的LB培養(yǎng)液中，進行擴增培養(yǎng)；于37℃震蕩培養(yǎng)4-5h，4℃、12000rpm離心10min，向上清液中加入占上清液1/6體積的PEG/NaCl溶液，4℃沉淀過夜；沉淀后，4℃、12000rpm離心15min，棄上清，再用TBST溶液懸浮噬菌體，加入占TBST溶液1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min；再4℃離心15min，去上清，沉淀用TBST溶液懸浮；

測定滴度后，進行第2次、第3次和第4次親和篩選；每次加入噬菌體的量為1×10¹¹~2×10¹¹pfu，包被的抗體量分別為75、50和25μg/ml；TBST溶液中Tween-20的含量從第2次篩選起增至0.5%，其余步驟與第1輪篩選相同，第4次篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選若干藍色噬菌斑，分別接種處于對數(shù)生長期前期的E.coli ER2738的LB培養(yǎng)液中進行擴增培養(yǎng)，純化并測定滴度；

（2）鑒定噬菌體克隆