[發明專利]基于M13噬菌體檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及制備方法

有效

• 申請號: 201410174931.3
• 申請日: 2014-04-29
• 公開（公告）號: CN103969444A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 胡驍飛;張改平;邢廣旭;王耀;王方雨;趙東;鄧瑞廣
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/558
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種基于M13噬菌體檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙，包括底層的支撐層、中間層的吸附層和固定在吸附層上的保護層，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其特征在于：在纖維素膜層上設有用展示OTA模擬表位的M13噬菌體印制的隱形檢測印跡，還設有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡；所述金標抗體纖維層采用吸附金標抗體的玻璃纖維棉制成，金標抗體采用膠體金納米顆粒標記的OTA的單克隆抗體或多克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的免疫層析試紙，其特征在于：所述OTA模擬表位的多肽序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。

3.根據權利要求1或2所述的免疫層析試紙，其特征在于：所述M13噬菌體由以下方法篩選，具體步驟為：

（1）親和篩選M13噬菌體隨機七肽庫

取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，每孔加入稀釋后的噬菌體肽庫100μL，其中含噬菌體1×10¹¹~2×10¹¹pfu，室溫下輕搖震蕩1h，棄去液體；沉淀用TBST溶液洗滌10次，洗去未結合的噬菌體后，每孔加入100μL pH2.2的洗脫液Gly-HCl，室溫下輕搖震蕩8min，吸出洗脫液，加入中和緩沖液至中性；中和后的洗脫液除留一部分作滴度測定外，其余的洗脫液接種處于對數生長前期的E. coli ER2738的LB培養液中，進行擴增培養；于37℃震蕩培養4-5h，4℃、12000rpm離心10min，向上清液中加入占上清液1/6體積的PEG/NaCl溶液，4℃沉淀過夜；沉淀后，4℃、12000rpm離心15min，棄上清，再用TBST溶液懸浮噬菌體，加入占TBST溶液1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min；再4℃離心15min，去上清，沉淀用TBST溶液懸浮；

測定滴度后，進行第2次、第3次和第4次親和篩選；每次加入噬菌體的量為1×10¹¹~2×10¹¹pfu，包被的抗體量分別為75、50和25μg/ml；TBST溶液中Tween-20的含量從第2次篩選起增至0.5%，其余步驟與第1輪篩選相同，第4次篩選后的洗脫產物經滴度測定后，從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選若干藍色噬菌斑，分別接種處于對數生長期前期的E.coli ER2738的LB培養液中進行擴增培養，純化并測定滴度；

（2）鑒定噬菌體克隆

取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，加入要鑒定的噬菌體克隆，37℃作用1h，用PBST溶液洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標記的抗M13的單克隆抗體，37℃作用1h，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加入2mol/L的H₂SO₄終止反應，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值≥空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；

然后采取競爭ELISA方法鑒定陽性噬菌體克隆的敏感性，加入不同濃度的OTA稀釋液和陽性噬菌體，于37℃作用1h，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加2mol/L的H₂SO₄終止反應，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值≥空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；計算各濃度下噬菌體的結合率，并作標準曲線判斷噬菌體克隆的敏感性；

（3）DNA測序及多肽序列分析

將擴增后的噬菌體進行測序，根據插入的DNA序列翻譯出氨基酸序列，采用的- 96 gⅢ測序引物為5′- ^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′，模擬表位的氨基酸序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。

4.根據權利要求1-3任一項所述的免疫層析試紙，其特征是：所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。