[發(fā)明專利]利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血紅蛋白濃度的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410174460.6
• 申請日: 2014-04-28
• 公開（公告）號: CN103954717A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒琳;余朝文;張娟;袁召建;苗靜琨;劉浩;萬科星;劉珊
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11308
• 代理人: 黎昌莉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及儀器分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用液相色譜和質(zhì)譜測定血液中血紅蛋白濃度的方法，尤其能測定微量且經(jīng)較長時間保存的血液標本血紅蛋白的濃度。

背景技術(shù)

血紅蛋白作為紅細胞內(nèi)的一種機能蛋白，氧氣結(jié)合在鐵原子上，被血液運輸。血紅蛋白在生物體內(nèi)，起傳輸氧氣、分解H₂O₂、傳遞電子等與氧和能量代謝有關(guān)的重要活動。由于臨床上白血病、貧血及心臟病等常伴有血紅蛋白異常，因此，人血清中血紅蛋白含量的測定是評價人體健康水平的一個重要指標。

已知，血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)由一個珠蛋白和四個血紅素(又稱亞鐵原卟啉)組成，每個血紅素又由四個吡咯類亞基組成一個環(huán)，環(huán)中心為一個亞鐵離子。每個珠蛋白則有四條多肽鏈組成，珠蛋白的四條肽鏈各不相同。成年人可由2條α鏈和2條β鏈構(gòu)成，稱HbA，胎兒由2條α鏈2條γ鏈構(gòu)成，稱HbF，出生后不久由HbA取代。珠蛋白的每條多肽鏈與一個血紅素連接，構(gòu)成血紅蛋白的一個單體，或者說亞單位(即亞基)。

基于此，人們建立了大量分析血紅蛋白濃度的方法，包括光度法、熒光法、電化學(xué)法等。具體如：氰化高鐵法(HiCN法)，其原理為：血紅蛋白在高鐵氰化鉀和氰化鉀的作用下，生成極為穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白(紅色)，其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比；氰化高鐵血紅蛋白在540nm波長下，毫克分子消光系數(shù)為44，據(jù)此，用分光光度法測其吸光度，從而得出血紅蛋白的定量測定。除此以外，還有如氧合血紅蛋白法、各型血紅蛋白儀測定等。

在遺傳代謝病篩查、貧血以及營養(yǎng)改善狀況等的普查中，往往涉及多個樣本的采集。出于成本和可行性的考慮，對這些樣本的測試難以及時進行，通常需累積一定樣本后，到特定的地點集中進行測試。其間，由于樣本的長期保存、長距離運輸以及環(huán)境溫濕度的影響，到測試時血紅蛋白已經(jīng)遭到破壞。由于上述已有方法均是基于血紅蛋白結(jié)構(gòu)完整情況下的生物活性或理化性質(zhì)而進行的檢測，當血液標本保持時間過長，可能發(fā)生溶血或血紅蛋白裂解時，測定的結(jié)果就難以反映標本采集時血紅蛋白的真實濃度，且實驗操作繁瑣，測試效率低。

液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)又叫液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，實現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準確的定量和定性分析，而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便，因此廣泛應(yīng)用于藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域。

串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀對于液相色譜－質(zhì)譜/質(zhì)譜應(yīng)用來說是權(quán)威的分析工具，分析者可以采用最少的樣品制備步驟，對少量化合物進行高通量的定量分析。該質(zhì)譜儀通過連續(xù)放置多個分析器來實現(xiàn)空間串聯(lián)的多級質(zhì)譜分析。每個分析器有以下單獨的作用：第一個四極桿(Q1)根據(jù)設(shè)定的質(zhì)荷比范圍掃描和選擇所需的離子；第二個四極桿(Q2)，也稱碰撞池，用于聚集和傳送離子，在所選擇離子的飛行途中，引入碰撞氣體，例如氮氣等；第三個四極桿(Q3)用于分析在碰撞池中產(chǎn)生的碎片離子。在母離子掃描中，Q1測定母離子，Q2碰撞池產(chǎn)生碎片離子，Q3測定某個特定的碎片離子，因此可在非常復(fù)雜的混合物中監(jiān)測某種特定的分子。

基于上述原因和現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明探索了血紅蛋白濃度測定的新方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供一種基于血紅蛋白的裂解片段作為標志肽段在血紅蛋白濃度測定中的應(yīng)用。由于采用血紅蛋白的裂解片段作為標志肽段進行測試，故不要求血紅蛋白的構(gòu)象完整，能測定微量且經(jīng)較長時間保存的血液標本的血紅蛋白濃度。

進一步，所述應(yīng)用為采用質(zhì)譜測定血紅蛋白濃度中的應(yīng)用。

進一步，所述應(yīng)用為采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血紅蛋白濃度中的應(yīng)用。

進一步，所述標志肽段為SEQ?ID?NO：1～11中的一條或多條。

具體地，本發(fā)明提供一種測定血紅蛋白濃度的方法，能測定微量且經(jīng)較長時間保存的血液標本的血紅蛋白濃度。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種測定血紅蛋白濃度的方法，包括以下步驟：

A、取血紅蛋白樣品進行分解，得珠蛋白多肽鏈的裂解片段；

B、對所述裂解片段進行分離，以分離獲得的一條或多條裂解片段為標志肽段，利用質(zhì)譜進行定量測試；