[發明專利]一段重組基因及提高黑曲霉表達糖化酶的方法

有效

• 申請號: 201410173213.4
• 申請日: 2014-04-25
• 公開（公告）號: CN103937766B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發明（設計）人: 白挨璽;孫健;卞芙蓉;張垠;李峰;徐鳳;徐紅;潘金龍;章方良
• 申請（專利權）人: 南京百斯杰生物工程有限公司
• 主分類號: C12N9/34
• 分類號: C12N9/34;C12N15/52;C12N1/15;C12R1/685
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,夏平

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一段重組基因及提高黑曲霉表達糖化酶的方法。

背景技術

糖化酶(1,4-α-D-萄聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化淀粉或寡糖等多糖分子的非還原端釋放出D-葡萄糖的酶。在商業上，糖化酶是由包括黑曲霉和米曲霉在內的幾種絲狀真菌和酵母生產的。絲狀真菌作為細胞工廠生產有價值的產品(如酶)為人們熟知，其中尤以黑曲霉和米曲霉由于被國際普遍認定為安全菌(Generally?Recognized?As?Safe，GRAS)的特征而被廣泛用于表達宿主，從而用于生產食品添加劑。

最初，科學家及商業公司通過傳統的菌種選育方法進行育種，從而提高某種目的產物(如糖化酶)的表達量或產量。例如，利用紫外照射或者化學誘變劑處理曲霉后，針對特定產物對其進行篩選，從而獲得高產菌株。隨著分子生物學技術的發展，人們開始利用基因工程方法進行微生物育種。要獲得高產量(或高表達量)菌株，例如提高酶的表達量，首先需要選擇特定的啟動子(誘導型或組成型)，隨后對要表達的基因進行優化。除此之外，還需要適合的終止子序列。這樣由啟動子，編碼序列及終止子序列進行串聯即可得到表達盒。將目的表達盒與特定的選擇標記連接后，可轉入到微生物體內。這些表達盒可以定點插入到基因座中，也可以隨機插入到基因座中。曲霉轉化技術原理遵循非同源斷裂修復機理，造成利用同源重組進行定點插入到基因座中比較困難，因此現有曲霉育種方法大都使用隨機插入到基因座中，隨后再根據需要對轉化子進行大規模篩選，以獲得目的菌株。這樣的方法費時費力，且結果不可預見。理論上講，篩選越多轉化子，獲得優勢菌株的可能性越大。

曲霉如黑曲霉的DNA轉化技術主要有聚乙二醇介導的化學轉化法、電擊轉化法及根癌農桿菌介導轉化法。無論上述何種方法，他們的共同特點都是轉化效率極其低下，每微克DNA的轉化效率只有幾個到幾百個轉化子，要比細菌(如大腸桿菌)及酵母(如釀酒酵母)轉化效率低幾個數量級。再加上曲霉的篩選費時費力，因此與傳統誘變-篩選育種一樣，隨機整合DNA育種過程也需要耗費大量時間和勞動成本，且結果不可預見。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一個定點整合糖化酶基因到黑曲霉菌種染色體中，實現對糖化酶高表達的技術方案。

本發明的另一目的是提供一段重組基因。

一種提高黑曲霉表達糖化酶的方法，通過同源重組的方法，將糖化酶表達盒和選擇標記基因定點整合到黑曲霉An12g08830基因座，再通過常規的抗性篩選和發酵培養重組黑曲霉獲得糖化酶。

具體地，定點整合基因座被確定為An12g08830(參照黑曲霉CBS513.88基因組)，首先選取基因座側翼5’及3’序列作為同源側翼序列，同源側翼序列片段大小優選100-5000bp，優選1000-3000bp，更優選2000bp。選取側翼序列是為了實現定點糖化酶表達盒的敲入。本領域技術人員應當知曉，同源序列越長，越容易發生同源重組，但是長序列的體外操作可能存在一定困難。同源序列越短，體外操作越容易，但是定點整合的幾率也會降低。通常是在整合幾率與操作難易之間選擇一個均衡的長度。

為了構建糖化酶表達盒，首先需要選擇必須的啟動子。啟動子可以是黑曲霉內源啟動子，如黑曲霉糖化酶啟動子，中性淀粉酶啟動子，酸性淀粉酶啟動子，α-葡萄糖苷酶啟動子等。也可以是外源啟動子。如米曲霉中性淀粉酶啟動子，米根酶糖化酶啟動子。也可以是啟動子變體，如黑曲霉中性淀粉酶變體。與啟動子3’末端連接的可以是調控序列，如合適的前導序列，即對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區。如米曲霉中性淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶前導序列。

糖化酶基因可以選擇黑曲霉內源基因，也可以來自其他種如米曲霉，米根酶，踝節菌屬，青霉屬。本發明優選黑曲霉糖化酶(AnGA)和埃莫森踝節菌糖化酶(TeGA)。

優選的終止子從如下酶的基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。