[發明專利]一段重組基因及提高黑曲霉表達糖化酶的方法

有效

• 申請號: 201410173213.4
• 申請日: 2014-04-25
• 公開（公告）號: CN103937766B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發明（設計）人: 白挨璽;孫健;卞芙蓉;張垠;李峰;徐鳳;徐紅;潘金龍;章方良
• 申請（專利權）人: 南京百斯杰生物工程有限公司
• 主分類號: C12N9/34
• 分類號: C12N9/34;C12N15/52;C12N1/15;C12R1/685
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,夏平

1.一種提高黑曲霉表達糖化酶的方法，其特征在于通過同源重組的方法，將糖化酶表達盒和選擇標記基因定點整合到黑曲霉An12g08830基因座，再通過常規的抗性篩選和發酵培養重組黑曲霉獲得糖化酶。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于選取黑曲霉An12g08830基因座側翼5‘及3’100‐5000bp序列作為同源側翼序列。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于選取黑曲霉An12g08830基因座側翼5‘及3’500bp‐5000bp序列作為同源側翼序列，優選選取黑曲霉An12g08830基因座側翼5‘及3’1000‐3000bp序列作為同源側翼序列，進一步優選選取黑曲霉An12g08830基因座側翼5‘及3’2000bp序列作為同源側翼序列。

4.根據權利要求1～3任一項所述的方法，其特征在于所述的同源重組，需兩段序列共同轉化黑曲霉，第一段序列由An12g08830基因座5‘側翼序列與第一段選擇標記基因鏈接，第二段序列由An12g08830基因座3‘側翼序列與糖化酶表達盒及第二段選擇標記基因順序鏈接，第一段序列與第二段序列在選擇標記基因部分具有同源序列。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的第一段序列與第二段序列在選擇標記部分具有至少100bp的同源序列。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述的糖化酶表達盒主要由啟動子、糖化酶基因及終止子組成。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的啟動子選自黑曲霉內源啟動子、外源啟動子或啟動子變體。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述的黑曲霉內源啟動子選自黑曲霉糖化酶啟動子、中性淀粉酶啟動子、酸性淀粉酶啟動子或α‐葡萄糖苷酶啟動子；所述的外源啟動子選自米曲霉中性淀粉酶啟動子、米根酶糖化酶啟動子；所述的啟動子變體選自黑曲霉中性淀粉酶變體。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的糖化酶表達盒還可以包括調控序列，調控序列為對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區，優選米曲霉中性淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶前導序列。

10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的糖化酶基因選自黑曲霉內源基因，或來自其他種屬的糖化酶基因。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述的其他種屬的糖化酶基因選自米曲霉，米根酶，踝節菌屬或青霉屬的糖化酶基因及突變體，優選黑曲霉糖化酶和埃莫森踝節菌糖化酶及突變體。

12.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的終止子從如下酶的基因獲得：米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶基因、黑曲霉α‐葡糖苷酶基因或尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因。

13.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的選擇標記基因數量為一個或多個，其表達產物提供抗生素抗性、殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養缺陷型的原養性。

14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于所述的選擇標記基因選自乙酰胺酶基因、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶基因、草銨膦乙酰轉移酶基因、潮霉素磷酸轉移酶基因、硝酸還原酶基因、乳清酸核苷‐5’‐磷酸脫羧酶基因、硫酸腺苷酰轉移酶基因、鄰氨基苯甲酸合酶基因或它們的等同物，優選構巢曲霉或米曲霉的乙酰胺酶基因或潮霉素磷酸轉移酶基因。

15.一段用于提高黑曲霉表達糖化酶的重組基因，其特征在于該基因為通過同源重組的方法，將糖化酶表達盒和選擇標記基因定點整合到黑曲霉An12g08830基因座所得。

16.根據權利要求15所述的重組基因，其特征在于選取黑曲霉An12g08830基因座側翼5‘及3’100‐5000bp序列作為同源側翼序列，優選選取黑曲霉An12g08830基因座側翼5‘及3’1000‐3000bp序列作為同源側翼序列，進一步優選選取黑曲霉An12g08830基因座側翼5‘及3’2000bp序列作為同源側翼序列。