[發(fā)明專利]一種流感病毒通用疫苗及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410173067.5
• 申請(qǐng)日: 2014-04-26
• 公開（公告）號(hào): CN103948942A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 單虎;李桂梅;黃娟;張傳美;劉煥
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種流感病毒通用疫苗及其制備方法，屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

流行性感冒病毒(Infuenza?virus，IV)簡(jiǎn)稱流感病毒，屬正粘病毒科。其臨床特征是高熱、呼吸困難以及其他各系統(tǒng)程度不同的臨床癥狀。該病的流行特點(diǎn)是發(fā)病急驟、傳播迅速、感染譜廣、流行范圍大，可引起多種動(dòng)物出現(xiàn)大批死亡。?

由流感病毒引起的流行性感冒廣泛分布于世界各地，而且歷史已久，關(guān)于本病的報(bào)道不僅包含雞群還包含豬群，近年來(lái)，隨著各地養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽的流通大幅增加，流感病毒的感染日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失，成為危害畜牧業(yè)發(fā)展的重大疫病之一。本病發(fā)病急驟，疫苗免疫接種是預(yù)防本病的有效措施。?

本發(fā)明的目的是制備出一種安全、有效的流感病毒通用疫苗。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是利用流感H1N1病毒株作為生產(chǎn)疫苗的毒株，通過(guò)雞胚培養(yǎng)的方法進(jìn)行病毒增殖，并利用基因工程的方法進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，將其與pCAGGS真核表達(dá)載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化及克隆，制備一種流感病毒通用疫苗，從而達(dá)到減少畜禽在注射疫苗后的不良反應(yīng)又能增強(qiáng)其對(duì)該病毒的應(yīng)答反應(yīng)。?

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下：?

一方面，本發(fā)明提供一種流感病毒通用基因疫苗，其特征在于：由克隆?有流感H1N1病毒株的HA2基因的pCAGGS真核表達(dá)載體構(gòu)成。?

另一方面，本發(fā)明提供上述流感病毒通用基因疫苗的制備方法，具體步驟如下：?

1)流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取；?

2)流感病毒重組質(zhì)粒的制備；?

3)將重組質(zhì)粒進(jìn)行濃度調(diào)整，分裝至不同EP管中，獲得疫苗成品。?

優(yōu)選地，所述的流感H1N1病毒株的HA2基因的獲取步驟包括：將A/Puerto?Rico/8/1934(H1N1)病毒株倍比稀釋，并將稀釋產(chǎn)物接種9-11日齡的SPF雞胚，進(jìn)行病毒的大量擴(kuò)增，48h后收取雞胚尿囊液，利用引物進(jìn)行HA2基因的大量擴(kuò)增，并對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)物回收。?

優(yōu)選地，引物序列為：?

正向引物：5’-ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3’?

反向引物：5’-AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3’?

優(yōu)選地，流感病毒重組質(zhì)粒的制備步驟包括：對(duì)獲取的HA2基因及pCAGGS真核表達(dá)載體進(jìn)行ClaⅠ/BglⅡ雙酶切，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收及連接轉(zhuǎn)化，并作大量擴(kuò)增，從克隆產(chǎn)物中提取重組質(zhì)粒。?

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的轉(zhuǎn)化及大量擴(kuò)增是將目的基因與表達(dá)載體連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌中，利用常見的含有氨芐青霉素的LB溶液過(guò)夜培養(yǎng)即可。?

再一方面，本發(fā)明提供流感H1N1病毒株的HA2基因和pCAGGS真核表達(dá)載體在制備流感病毒通用基因疫苗中的用途。?

本發(fā)明的流感病毒通用疫苗的用途，主要用于控制流感病毒病。

附圖說(shuō)明

圖1為免疫天數(shù)與HA特異性抗體滴度關(guān)系的圖。?

具體實(shí)施方式

1.A/Puerto?Rico/8/1934(H1N1)病毒株HA2基因擴(kuò)增。?

(1)取9-11日齡的SPF雞胚，于尿囊腔中接種0.2mL/胚的病毒液，37℃孵育，收集24-48h自然死亡或未死亡雞胚尿囊液。血凝試驗(yàn)(HA)測(cè)定病毒的滴度，將有血凝滴度的尿囊液保存于-80℃?zhèn)溆谩?

(2)根據(jù)Genbank上收錄的HA2基因核酸序列(SEQ?ID：NO.1)設(shè)計(jì)引物并引入限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，利用分子生物學(xué)方法對(duì)病毒中的HA2基因進(jìn)行大量擴(kuò)增。?

其中，引物序列為：?

正向引物：5’-ATCGATGGTCTATTTGGAGCCAT-3’?

反向引物：5’-AGATCTGATGCATATTCTGCACT-3’?

(3)對(duì)HA2基因進(jìn)行回收，并利用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ/BglII進(jìn)行雙酶切使HA2暴露出粘性末端。?

2.粘性末端真核表達(dá)載體的制備?

取由哈爾濱獸醫(yī)研究所贈(zèng)與的pCAGGS真核表達(dá)載體質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ/BglII進(jìn)行雙酶切使載體暴露出粘性末端，以方便其余目的基因進(jìn)行連接。?

3.成品的制備?