[發(fā)明專(zhuān)利]基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的胡蘿卜成分快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410171512.4
• 申請(qǐng)日: 2014-04-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103993075A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫敏;高宏偉;肖西志;劉彩霞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的胡蘿卜成分快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其中的試劑包括（1）-（4）：

（1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A

包括10×Bst?buffer反應(yīng)緩沖液、1-2mmol/L?dNTP、5-7mmol/L硫酸鎂、0.8-1μmol/L上游內(nèi)引物、0.8-1μmol/L下游內(nèi)引物、0.1-0.2μmol/L上游外引物、0.1-0.2μmol/L下游外引物、0.4-0.6μmol/L上游環(huán)引物、0.4-0.6μmol/L下游環(huán)引物和0.7-0.9mol/L甜菜堿；

其中10×Bst?buffer反應(yīng)緩沖液含有200mmol/L?pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；

其中上游內(nèi)引物的序列為：5'-AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC-3'；下游內(nèi)引物的序列為：5'-?GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA-3'；上游外引物的序列為：5'-?GAAATTGGCCTCCCGTGC-3'；下游外引物的序列為：5'-?GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3'；上游環(huán)引物的序列為：5'-CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA-3'；下游環(huán)引物的序列為：5'-GGCCCTTGGGCACAGCAAA-3'；

其中上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物、上游環(huán)引物、下游環(huán)引物體積比為：8:8:1:1:4:4；

（2）Bst?DNA聚合酶B：8U/μL；

（3）顯色劑C：熒光染料SYBR?Green；

（4）陽(yáng)性對(duì)照D：胡蘿卜基因組DNA，20ng/μL。

2.一種利用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)胡蘿卜成分的方法，其特征是依次包括下列步驟：

（1）待檢樣品DNA的提取；

（2）胡蘿卜成分的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增：

A.?在裝有20μL如權(quán)利要求1所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1μL?Bst?DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；

B.?于恒溫水浴上63℃放置40min；

C.?將水浴調(diào)到85℃中止反應(yīng)，5min后取出待檢；

擴(kuò)增時(shí)，設(shè)立2個(gè)對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照為胡蘿卜基因組DNA、空白對(duì)照為不含DNA模板的水；

（3）顯色檢測(cè)

在待檢的每個(gè)反應(yīng)管中加入1μL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化。

3.如果樣品的擴(kuò)增反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說(shuō)明待檢樣品含有胡蘿卜成分；如果顏色為橙色，則說(shuō)明待檢樣品不含有胡蘿卜成分。