[發(fā)明專利]對L-抗壞血酸進(jìn)行微生物生產(chǎn)的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410171433.3
• 申請日: 2004-08-16
• 公開（公告）號: CN104004776A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 阿蘭·貝利;康妮·李;安妮·弗朗索瓦·邁耶;新城雅子
• 申請（專利權(quán)）人: 帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/04;C12R1/19;C12R1/02;C12R1/01
• 代理公司: 北京東方億思知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11258
• 代理人: 肖善強(qiáng)

本發(fā)明是申請日為2004年8月16日、申請?zhí)枮?00480023361.2、題為“對L-抗壞血酸進(jìn)行微生物生產(chǎn)的方法”的申請的分案申請。

本發(fā)明涉及從編碼能將L-山梨糖酮(L-sorbosone)直接轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸的酶的多核苷酸獲得的(derived)多核苷酸。L-山梨糖酮脫氫酶(下文中：SNDHai)能從L-山梨糖酮直接生產(chǎn)L-抗壞血酸(維生素C)。L-山梨糖酮脫氫酶(SNDHai)是從屬于Gluconobacter屬和Acetobacter屬的細(xì)菌獲得的。本發(fā)明還涉及以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法。L-抗壞血酸廣泛用于制藥、食品和化妝品工業(yè)。

在過去的70年中，已通過公知的Reichstain方法從D-葡萄糖對L抗壞血酸(維生素C)進(jìn)行了工業(yè)生產(chǎn)。該方法中的所有步驟都是通過化學(xué)方式進(jìn)行的，只除了其中一個(gè)(從D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化)，其通過微生物轉(zhuǎn)化來進(jìn)行。自從對L-抗壞血酸的工業(yè)生產(chǎn)的最初開始，就已將多種化學(xué)方法和技術(shù)修飾用于提高Reichstain方法的效率。對維生素C生產(chǎn)的最新進(jìn)展被概括于Ullmann’s?Encyclopedia?of?Industrial?Chemistry，5th?Edition，Vol.A27(1996)，pp.547ff。近來，已在微生物或從中分離出的酶的協(xié)助下，來進(jìn)行生產(chǎn)維生素C的不同步驟。

目前用于生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法具有一些人們不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有機(jī)及無機(jī)溶劑。因此，在過去數(shù)十年中，人們已在研究用微生物轉(zhuǎn)化來制造L-抗壞血酸的其它方法，所述方法將是更加經(jīng)濟(jì)以及環(huán)保的。已報(bào)道了在多種微生物中直接對L-抗壞血酸的生產(chǎn)。

令人驚奇地，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，可用分離自G.oxydans?N44-1的L-山梨糖酮脫氫酶(下文中：SNDHai)，或來自屬于Gluconobacter屬和Acetobacter屬的乙酸細(xì)菌的其直向同源體(ortholog)，來進(jìn)行L-山梨糖酮向L-抗壞血酸的直接轉(zhuǎn)化。用于該反應(yīng)的基因被分離出，對其進(jìn)行測序。通過該基因編碼的山梨糖酮脫氫酶能將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸。該酶與已知的SNDH酶不同。

術(shù)語“L-抗壞血酸”和“維生素C”在本文中可以互換使用，其可以是水溶液中發(fā)現(xiàn)的L-抗壞血酸的任何化學(xué)形式，例如未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽的形式為陰離子，同時(shí)存在通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵上清液中的任何種類的陽離子，例如，鉀、鈉、銨或鈣。還包括在內(nèi)的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經(jīng)過分離的晶體。另一方面，用其相應(yīng)的鹽的名稱來命名L-抗壞血酸的鹽形式的經(jīng)過分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鈣等。

L-山梨糖酮向維生素C的轉(zhuǎn)化表示：導(dǎo)致維生素C產(chǎn)生的對底物的轉(zhuǎn)化是通過SNDHai來進(jìn)行的，即，底物被直接轉(zhuǎn)化為維生素C。

克隆載體可以例如是任何質(zhì)粒或噬菌體DNA或能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的其它DNA序列，所述序列有如下特征：其具有一個(gè)或少量的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，可在這些位點(diǎn)以可確定的方式對此類DNA序列進(jìn)行切割，而不會(huì)導(dǎo)致載體的基本生物學(xué)功能的損失，還可向這些位點(diǎn)接合進(jìn)DNa片段，以使得復(fù)制發(fā)生。克隆載體還可含有，例如，適用于對經(jīng)過克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)識的標(biāo)記。此類標(biāo)記可以提供，例如，對抗生素的抗性，例如，對四環(huán)素或氨芐青霉素的抗性。

表達(dá)載體可以是能增強(qiáng)被克隆進(jìn)來的基因的表達(dá)的任何載體，例如在轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主之后。被克隆的基因通常處于某些控制序列的控制之下(即，與其可操作地連接)，例如啟動(dòng)子序列。啟動(dòng)子序列可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。

核酸分子可以包括DNA和RNA。任何形式的，例如雙鏈的、單鏈的核酸以及其核苷可被用作為核酸分子。還包括在內(nèi)的有雜交體，例如，DNA-RNA雜交體、DNA-RNA-蛋白質(zhì)雜交體、RNA-蛋白質(zhì)雜交體和DNA-蛋白質(zhì)雜交體。多核苷酸可由若干堿基組成，通常至少20個(gè)核苷酸堿基。

術(shù)語“同源性(homology)”指兩條多核苷酸序列間的相似性。為確定同源性，將多核苷酸序列以使相似的區(qū)域能被比較的方式排列起來。如果需要的話，某些位置上的核苷酸可被空位置代替，以提高相似性。同源性比較可以例如通過手工或通過使用商業(yè)可獲得的計(jì)算機(jī)程序來進(jìn)行。優(yōu)選地，所述程序在標(biāo)準(zhǔn)條件下運(yùn)行，以獲得最大的同源性。兩條核苷酸序列之間同源性或相似性的程度被表示為“％同源性”。