[發(fā)明專利]檢測水和水稻植株中的井岡霉素A的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410169872.0
• 申請日: 2014-04-25
• 公開（公告）號: CN104280495A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張昌朋;趙華;吳珉;平立鳳;朱亞紅;張春榮;何紅梅;湯濤
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/14
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 向慶寧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析檢測領(lǐng)域，特別的，屬于井岡霉素A在水和水稻植株中的分析檢測方法。背景技術(shù)

井岡霉素(validamycin)是由水鏈霉菌井岡變種產(chǎn)生的水溶性抗生素，共有A、B、C、D、E、F6種組分，主要活性物質(zhì)為井岡霉素A，一般產(chǎn)品中均以A組分的含量來標(biāo)示產(chǎn)品的規(guī)格及產(chǎn)品的質(zhì)量。井岡霉素為我國獨立開發(fā)研制的生物源殺菌劑，至今未見有關(guān)抗藥性上升的報道，也無變異菌種的報道，主要用于防治水稻紋枯病菌，對絲核菌亦有良好生物活性，具有強(qiáng)內(nèi)吸性，兼具保護(hù)和治療作用，是我國南方稻區(qū)防治水稻紋枯病的主要藥劑品種，使用量大。

井岡霉素A(Validamycin?A)的化學(xué)名稱為N-[(1S)-(1,4,6/5)-3-羥甲基-4,5,6-三羥基-2-環(huán)己烯]-(O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-(1S)-(1,2,4/3,5)-2,3,4-三羥基-5-羥甲基環(huán)己胺(A組分)；化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

分子式C₂₀H₃₅NO₁₃，分子量497.23。井岡霉素?zé)o一定熔點，95-100℃軟化，約135℃分解。易溶于水，可溶于甲醇、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，微溶于乙醇和丙酮，不溶于乙酸乙酯、氯仿、乙醚、苯和石油醚。

井岡霉素A是氨基糖苷類化合物，分子中含多個極性基團(tuán)，難于氣化，不能直接進(jìn)行氣相色譜分析。對井岡霉素A原藥和制劑的分析多采用高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、離子交換色譜法、薄層熒光法及填充柱氣相色譜衍生化方法等。許鵬軍等采用柱前衍生化毛細(xì)管氣相色譜法測定了土壤中井岡霉素A的殘留。余曉江等研究并建立了井岡霉素A在大米和稻殼中的殘留分析方法。樣品經(jīng)溶劑提取，C₁₈固相萃取小柱凈化后，用液相色譜檢測。但是這些方法需要前期的復(fù)雜的提取步驟，提取凈化過程較復(fù)雜，且凈化效果不理想。有待對這些方法進(jìn)行改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容

為了改進(jìn)現(xiàn)有的方法，本發(fā)明一方面，本發(fā)明提供一種田水中井岡霉素A的提取和凈化的方法，該方法包括以下步驟：

1)、量取田水樣品10mL到刻度管中，加入甲酸水，調(diào)節(jié)田水的pH值為2-3，混勻，待凈化；

2)、凈化的步驟包括：提供MCX小柱，3cc/60mg,；用3mL甲醇和3mL水分別按照順序添加進(jìn)行活化MCX小柱，2mL的經(jīng)0.2％甲酸水酸化后的田水樣品全部上樣，3mL甲醇淋洗，用吸耳球吹干MCX小柱中的液體；3mL的5％氨水甲醇溶液洗脫MCX小柱，洗脫液在50℃條件下濃縮干，用甲醇定容到2.0mL，過0.22μm濾膜，進(jìn)行檢測。

在一些優(yōu)選的方式中,10mL田水樣品中加入10mL0.2％甲酸水，讓混合后的液體pH值為2.7。我們驚訝的發(fā)現(xiàn)，如果甲酸水太少或讓經(jīng)過甲酸水處理的田水樣本的pH值大于3，井岡霉素A不能被完全離子化，從而使井岡霉素A不能完全保留到MCX小柱上，最終不能達(dá)到凈化的目的。

相反，如果甲酸水太多，或讓處理的樣本pH值小于2，井岡霉素A將保留在MCX小柱上后，洗脫液(例如，5％氨水甲醇溶液)不能把井岡霉素A完全洗脫下來，這樣降低了在后續(xù)測試的井岡霉素A的濃度。

只有當(dāng)這個pH值為2～3的條件下，樣品過MCX小柱，能夠保證既把樣品保留在MCX小柱上，達(dá)到凈化的目的，用洗脫液(5％氨水甲醇溶液)又能夠把井岡霉素A完全洗脫下來。

我們也試圖尋找其他試劑來代替甲酸水，但是經(jīng)過多次試驗后，發(fā)現(xiàn)甲酸水的效果是最好的，例如使用鹽酸、醋酸等試劑，都不能獲得理想的凈化效果，而且在后續(xù)的進(jìn)行上樣檢測的時候，不能獲得更精確的檢測值，最低檢測濃度都很高。

在一些優(yōu)選的方式中，田水是指從田間直接采集的樣本，而不需要對樣本進(jìn)行任何前期的預(yù)處理，比如通過過濾、離心等方式除去田水中的顆粒雜質(zhì)、沉淀等。本發(fā)明的方法中，可以直接采集田間的水樣本(例如稻田里的水)進(jìn)行處理，并經(jīng)過后期的純化處理，直接進(jìn)行上樣測試。

在一些方式中，田水樣品10mL可以被任何樣品替代，例如，為了檢測植物中的井岡霉素A，一般先從植物中進(jìn)行井岡霉素A的提取，然后再經(jīng)過處理后，最終進(jìn)行井岡霉素A的測定。

從植物組織，例如水稻組織中提取井岡霉素A的方法如下：