[發明專利]一種牛β-防御素5成熟肽的制備方法及其重組菌和應用

無效

• 申請號: 201410168747.8
• 申請日: 2014-04-24
• 公開（公告）號: CN103981209A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 周向梅;趙德明;康靜靜;呂悅;尹曉敏;楊利峰
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/12;C07K14/47;A61K38/17;A61P31/00;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明屬于動物醫藥工程技術領域，具體涉及一種牛β-防御素5成熟肽的制備方法，還涉及一種表達牛β-防御素5成熟肽的重組菌，同時還涉及一種牛β-防御素5成熟肽在畜牧生產和藥物治療中抗菌作用的應用。

背景技術

防御素(defensin)屬于內源性抗菌肽(endogenousantibiotic?peptidees)家族，具備廣譜抗微生物和細胞毒活性，對機體免疫至關重要。1991年，人們在牛氣管黏膜上皮細胞中首次發現β-防御素-2這一陽離子多肽抗生素，命名為TAP(Trachea?Antiniobial?Peptide)，而后在牛的粒細胞中又發現了13種不同于α-防御素，卻與TAP序列高度同源的防御素，故命名為β-防御素。由于β-防御素的結構特點為基因序列中含有兩個exon，其中第二個exon編碼成熟的β-防御素，即發揮活性的部分，而且成熟β-防御素中含有6個半胱氨酸，可形成3對二硫鍵，是β-防御素能夠發揮生物活性的必要結構。但是動物體內天然防御素的含量較低，直接提取遠不能滿足需要，化學合成方法可行但成本太高，因此，通過基因重組技術生產防御素多肽，以滿足研究和生產的需要成為一種可能。

另外，有研究已證實牛巨噬細胞有牛嗜中性粒細胞β-防御素(BNBD)5的表達，且分支桿菌主要感染巨噬細胞，并在巨噬細胞內生存，因此，我們推測BNBD5可能在對抗分支桿菌感染中發揮著重要的作用，并可作為一種分支桿菌的新型治療藥物而廣泛使用，因此基于防御素的這一重要特點，我們進行了一種真核表達牛嗜中性粒細胞β-防御素5成熟肽的生產方法的研究。

發明內容

針對現有技術不足，本發明的目的是提供一種牛β-防御素5成熟肽的制備方法及其重組菌和應用。

為實現上述目的，本發明提供了一種真核表達載體，由含有牛β-防御素5成熟肽基因與真核表達載體pPIC9K構建而成的pPIC9K-mBNBD5，所述牛β-防御素5成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

一種編碼牛β-防御素5成熟肽的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明提供了一種重組菌株，由上述真核表達載體pPIC9K-mBNBD5轉化畢赤酵母GS115構建制成的重組菌株。

優選的，所述菌株為畢赤酵母陽性轉化子菌株巴斯德畢赤酵母Pichia?pastoris(pPIC9K-mBNBD5)，該菌株已于2014年3月20日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCC?No.8937。

本發明提供了一種牛β-防御素5成熟肽的制備方法，包括以下步驟：

1)牛β-防御素5成熟肽基因的制備：根據GenBank上公布的BNBD5的CDS區域核苷酸序列人工合成mBNBD5基因，并設計PCR引物，

mBNBD5的上游引物：

5′-GCCGAATTCAATCCTCAAAGCTGCCGTT-3′；

mBNBD5的下游引物：

5′-GCCGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCTCC?TGCAGCAT-3′；

2)上述真核表達載體的構建：雙酶切mBNBD5基因和真核表達載體pPIC9K，膠回收mBNBD5基因片段和開環的真核表達載體pPIC9K，16℃連接處理16h，將連接產物轉化至大腸桿菌TOP10感受態細胞，即完成重組質粒pPIC9K-mBNBD5的構建；

3)上述重組菌株的制備：將重組質粒pPIC9K-mBNBD5轉化到感受態GS115中，篩選陽性轉化子，所得陽性克隆即為能夠表達mBNBD5的畢赤酵母陽性轉化子菌株；

4)畢赤酵母陽性轉化子體外誘導表達。

優選的，步驟3)中所述篩選依次為His⁺多拷貝轉化子的篩選和Mut⁺轉化子的篩選。

優選的，所述步驟4)包括以下步驟：

a、挑取PCR鑒定后證實已插入目的片段的His⁺、Mut⁺酵母轉化子接種至YPD液體培養基中，28℃培養16-18h，離心棄上清；