[發明專利]一種牛β-防御素5成熟肽的制備方法及其重組菌和應用

無效

• 申請號: 201410168747.8
• 申請日: 2014-04-24
• 公開（公告）號: CN103981209A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 周向梅;趙德明;康靜靜;呂悅;尹曉敏;楊利峰
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/12;C07K14/47;A61K38/17;A61P31/00;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種真核表達載體，其特征在于，由含有牛β-防御素5成熟肽基因與真核表達載體pPIC9K構建而成的pPIC9K-mBNBD5，所述牛β-防御素5成熟肽基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.一種重組菌株，其特征在于，由權利要求1所述的真核表達載體pPIC9K-mBNBD5轉化畢赤酵母GS115構建制成的重組菌株。

3.根據權利要求2所述的重組菌株，其特征在于，所述菌株為巴斯德畢赤酵母Pichia?pastoris，保藏編號為CGMCC?No.8937。

4.一種牛β-防御素5成熟肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)牛β-防御素5成熟肽基因的制備：根據GenBank上公布的BNBD5的CDS區域核苷酸序列人工合成mBNBD5基因，并設計PCR引物，

mBNBD5的上游引物：

5′-GCCGAATTCAATCCTCAAAGCTGCCGTT-3′；

mBNBD5的下游引物：

5′-GCCGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCTCC?TGCAGCAT-3′；

2)權利要求1所述的真核表達載體的構建：雙酶切mBNBD5基因和真核表達載體pPIC9K，膠回收mBNBD5基因片段和開環的真核表達載體pPIC9K，16℃連接處理16h，將連接產物轉化至大腸桿菌TOP10感受態細胞，即完成重組質粒pPIC9K-mBNBD5的構建；

3)權利要求3所述重組菌株的制備：將重組質粒pPIC9K-mBNBD5轉化到感受態GS115中，篩選陽性轉化子，所得陽性克隆即為能夠表達mBNBD5的畢赤酵母陽性轉化子菌株；

4)畢赤酵母陽性轉化子體外誘導表達。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述篩選依次為His⁺多拷貝轉化子的篩選和Mut⁺轉化子的篩選。

6.根據權利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4)包括以下步驟：

a、挑取PCR鑒定后證實已插入目的片段的His⁺、Mut⁺酵母轉化子接種至YPD液體培養基中，28℃培養16-18h，離心棄上清；

b、重懸菌體接種至誘導表達前培養基BMGY中，28℃培養18-24h，至OD600nm達到2-6時離心棄上清；

c、重懸菌體接種至誘導表達培養基BMMY中，28℃連續培養72h，培養72h后收集表達培養液，離心取上清，進行Tricine-SDS-PAGE電泳分析，結果顯示，與空載體對照相比，含有目的片段的酵母表達上清在7kD處有一特異性條帶，說明有目的蛋白表達。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，誘導表達前培養基BMGY的配方為酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K₂HPO₄3g/L、KH₂PO₄11.8g/L、超純水800mL/L、10×YNB100mL/L、0.02％生物素的500×B1mL/L、10％甘油100mL/L。

8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，誘導表達培養基BMMY的配方為酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、K₂HPO₄3g/L、KH₂PO₄11.8g/L、超純水800mL/L、10×YNB100mL/L、0.02％生物素的500×B1mL/L、5％甲醇100mL/L。

9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟c中，培養過程中每隔24h補充甲醇使其終濃度為1％。

10.一種由權利要求4-9所述制備方法制得的牛β-防御素5成熟肽在抗微生物感染中的應用。