[發明專利]一種優化的電穿孔技術轉染懸浮細胞的方法

在審

• 申請號: 201410166759.7
• 申請日: 2014-04-24
• 公開（公告）號: CN103981218A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 侯雯婷;蔣衛;李慧;張超;李剛
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于哺乳動物細胞基因工程領域，具體是一種優化的電穿孔技術轉染懸浮細胞的方法，特別是適用于難轉染的CEMx174細胞系。

背景技術

轉染是將外源核酸導入真核細胞中并發揮其生物學作用的一種技術，導入的核酸包括DNA(質粒和線性雙鏈DNA)，反義寡核苷酸及RNAi(RNA?interference)。目前，基因轉染技術已廣泛應用于基因組功能研究(基因表達調控，基因功能，信號轉導和藥物篩選研究)和基因治療研究。

轉染技術根據時效可分為瞬時轉染和穩定轉染兩大類。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，可導入多個拷貝，獲得目的基因暫時的高水平表達，適用于在轉染后1～4天內收獲細胞，檢測目的基因表達結果的實驗。穩定轉染是用于建立單克隆的細胞系，使得目的基因整合到靶細胞染色體中或者以游離形態穩定存在于持續傳代培養的細胞中，指導目的基因的適量表達。一般來說，穩定轉染的表達效率比瞬時轉染低1～2個數量級，但是效果更持續穩定，重復性好。通常利用可選擇的遺傳標記物用藥物篩選出轉染成功的細胞，建立單克隆細胞系，如G418(新霉素抗性)，氨喋呤(胸苷激酶抗性)，嘌呤霉素(嘌呤霉素-N-乙酰基轉移酶抗性)。

現今常用的轉染方法可歸為三類：生化方法，病毒介導的方法以及物理方法。

生化方法是實驗室中最為常用的一種，是通過轉染試劑與核酸形成復合物后易化核酸接近貼壁的細胞并促進細胞的內吞作用使核酸進入細胞內，常用DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法，脂質體法等。但是由于細胞膜結構的差異，或是懸浮團簇狀生長的方式降低了復合物與細胞接觸的幾率，這類轉染方法對于懸浮細胞效果甚不理想。雖然有很多號稱可以轉染懸浮細胞的新型改良試劑，但其結果依然差強人意。

病毒介導的轉染通常是用逆轉錄病毒載體。它屬于RNA病毒，可在靶細胞內反轉錄產生DNA互補鏈，此DNA單鏈可作為模板合成第二條DNA鏈，第二條DNA鏈可摻入細胞基因組DNA中。此病毒可利用宿主細胞的酶自行轉錄與復制，RNA可合成蛋白，再包裝病毒，從胞內釋放，成為感染性病毒，其介導的過程可使病毒單拷貝基因組穩定地進入細胞。理論上，這種逆轉錄病毒載體介導的轉染方法可以獲得較高的轉染效率，但是其前期的準備工作繁瑣復雜，且存在一定的安全風險，不適合廣泛的應用。而且，根據本室的實踐研究，該方法轉染懸浮細胞的結果也并不理想。

而常用的物理方法有兩種：通過直接顯微注射將細胞膜穿孔并導入核酸，或利用短暫的電流脈沖在質膜上瞬時形成可讓核酸通過的微孔并使核酸在電場作用下主動進入細胞。前者主要用于轉基因動物的制備，不適于大量細胞的轉染。而電穿孔技術的應用范圍則更廣泛，可以快速、簡便、有效的將DNA導入包括細菌、酵母、植物細胞與多種培養的哺乳動物細胞中。

CEMx174細胞系是人T、B淋巴母細胞雜交株，由721.174(LCL721B淋巴母細胞系變種)和CEMR.3(CEM?T淋巴母細胞系的氮鳥嘌呤和烏巴音抵抗克隆株)雜交得來(Salter?RD，Howell?DN，1985)。該細胞株表達CXCR4(Strizki?JM?et?a1，1997)，CCR5(Miyagi?T?et?al，2000)，孤兒受體GPR15(Kiene?M?et?al，2012)等，是重要的SIV及HIV感染的細胞模型，廣泛用于病毒感染的機制以及臨床藥物作用的研究(Dong?MX?et?al，2012；Lim?HG?et?al，2008；Newman?JT?et?al，2007)。同時，CEMx174細胞系也表達阿片受體(μ/κ/Δ)，因此經常用于嗎啡等阿片類藥物的作用機理研究及臨床應用研究(Miyagi?T?et?al，2000；Jin?Xu?et?al，2004；Han?Liu?et?al，2009)。然而，CEMx174細胞系與其他的淋巴細胞系(如Jurkat、U937等)具有相同的生長特性，呈懸浮團簇狀生長在培養液中，同樣，轉染效率非常低，經常嚴重的阻礙實驗研究的進行。常用的脂質體轉染試劑或陽離子轉染試劑都不能達到讓人滿意的效果，轉染效率低而且重復性差，直接干擾了后續實驗的進行，對實驗結果的可信度和可靠性造成干擾。