[發明專利]一種單細胞克隆培養方法

無效

• 申請號: 201410166605.8
• 申請日: 2014-04-23
• 公開（公告）號: CN103923876A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 王立民;周平;甘尚權;唐紅;郭延華;張譯元
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒;劉鐵生

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，特別是涉及一種單細胞克隆培養方法。

背景技術

目前所用的單細胞克隆培養方法是將細胞無限稀釋，達到一定的稀釋濃度后在培養皿中培養或加入96孔板培養，以實現單個細胞的獨立生長成為克隆。培養皿中培養時，在培養皿中培養的細胞在貼壁前處于漂浮狀態，很容易與另一個細胞接觸或在同一個地方貼壁形成一個克隆，隨著細胞增殖數目增多，處于分裂狀態的細胞由于貼壁性較差，也會移動到別的細胞克隆里，不能完全保證克隆的單一來源性；另一方面由于最開始培養時為了防止細胞密度太大而導致多個細胞接觸成為一個克隆，細胞密度很低，使得細胞所處的環境非常大，細胞自身分泌的一些因子被極度稀釋，影響了細胞的自我調節和生長速度。在96孔板培養時，由于細胞的沉降速度存在差異，或者邊緣角落不容易看清楚，以及最少20μl的培養體系，存在相同的隱患和不足。此外，在篩選轉基因細胞時，由于部分細胞轉染效率低下，當轉染后只獲得數量很少的陽性細胞時，進行常規藥物篩選和單克隆培養具有很大的難度。

發明內容

本發明的目的是提出一種單細胞克隆培養方法，以解決單細胞克隆純度無法保證及培養困難的問題和低轉染效率細胞篩選難的問題。

為了解決上述技術問題，本發明采用了如下技術方案：一種單細胞克隆培養方法，包括以下步驟：

步驟1，制備培養液微滴：在培養皿的間隔位置逐一地加入第一體積的培養液，形成液滴；隨后用石蠟油覆蓋所述液滴，然后再向每個液滴內補入第二體積的培養液，形成培養液微滴；將其放入培養箱平衡，等待細胞的放入；

步驟2，準備顯微操作系統：利用拉針儀拉制出細胞操作針，并安裝到顯微操作儀上；

步驟3，篩選單克隆細胞：將待篩選的細胞消化成單細胞懸液并放入細胞培養皿中，利用步驟2所述的顯微操作系統根據篩選要求挑選目標細胞，將目標細胞逐一吸入顯微操作針內；

步驟4，利用步驟2所述的顯微操作系統將操作針內的目標細胞以每個液滴培養一枚細胞逐一放入步驟1的培養液微滴內，然后進行細胞培養；

步驟5，對步驟4中所培養細胞經過2天培養后，進行半量換液；

步驟6，擴大培養：對步驟4中經過4～5天培養形成的細胞克隆進行消化處理，分別將每個培養液微滴中消化出的細胞移入96孔板進行培養，獲得細胞數量更多的單細胞克隆。

如上所述的單細胞克隆培養方法，進一步，步驟1，第一體積的培養液的體積為1～2.5μl，第二體積的培養液的體積為1～2.5μl，培養液微滴總體積為2～5μl，形成培養液微滴。

如上所述的單細胞克隆培養方法，進一步，在顯微操作系統的顯微鏡觀察下，將目標細胞利用顯微操作系統逐一收集。

如上所述的單細胞克隆培養方法，進一步，所述半量換液是指吸去培養液微滴一半體積的培養液，重新補入37℃的與吸出體積相同的新鮮培養液。

與現有技術相比，本發明的有益效果在于：

本研究利用顯微操作系統和培養液微滴培養體系，可以在高倍鏡下仔細的挑選優質待篩選的細胞，再逐個的放入制作好的培養液微滴中，由于培養液微滴之間的石蠟油隔絕了微滴之間的接觸，而且放入細胞時是從顯微鏡中明確觀察到，不會存在多放入的情況，也避免了細胞處于懸浮狀態時的細胞相互“串門”，保證了細胞克隆的單一性；同時由于培養液微滴的體積為5μl，在細胞分泌生物因子后能夠很好的保證因子的濃度不擴散，為細胞的生長提供了一個很好的微環境。此外，由于是人為挑選，所以會對稀缺細胞實現高效篩選。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述，但不作為對本發明的限定。

為了解決現有技術中單細胞克隆培養方法的缺點，本發明的發明構思如下：一種單細胞克隆培養方法，包括以下步驟：