[發明專利]一種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201410166595.8
• 申請日: 2014-04-23
• 公開（公告）號: CN103966358A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 林強;付小哲;李寧求;吳淑勤;石存斌
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明涉及一種熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，具體涉及一種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

鱖魚(Siniperca chuatsi)是我國重要的淡水魚特色養殖種類之一，由傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）引起的鱖魚虹彩病毒病是鱖魚養殖的主要疫病，導致鱖魚死亡率接近100％，成為制約鱖魚養殖業發展的主要瓶頸。1997年，吳淑勤等首先在患病鱖魚中發現了直徑150nm的球形病毒，并認為是鱖魚暴發性傳染病的病原。何建國等通過回歸感染進一步證明了該病毒的病原性，通過組織學研究發現鱖魚脾臟和腎臟是其感染的主要器官，將其命名為傳染性脾腎壞死病毒，通過主衣殼蛋白（MCP）基因等序列分析確定其為一種虹彩病毒。

虹彩病毒是二十面體的胞質DNA病毒，直徑一般在120-200nm之間，可以感染節肢動物等無脊椎動物和魚類、兩棲、爬行等冷血脊椎動物。根據國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第八次報告，虹彩病毒科（Iridoviridae）下設虹彩病毒屬（Iridovirus）、綠虹彩病毒屬（Chloriridovirus）、蛙病毒屬（Ranavirus）、淋巴囊腫病毒屬（LympHocystivirus）和腫大細胞病毒屬（Megalocytivirus）五個屬，其中傳染性脾腎壞死病毒是腫大細胞病毒屬的代表種。由于腫大細胞病毒屬病毒對魚類養殖業的巨大危害，這個屬的病毒受到越來越多的重視，目前已有數十種腫大細胞病毒屬病毒被發現。但還未見熒光定量PCR應用于鱖魚傳染性脾腎壞死病毒檢測的報道。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量 PCR檢測試劑盒。

本發明的另一個目的是提供一組用于檢測鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量PCR特異性引物及探針。

本發明的另一個目的是提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量 PCR檢測方法。

本發明的另一個目的是提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度的熒光定量 PCR檢測方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種鱖傳染性脾腎壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下組分：針對鱖傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）的特異性引物及探針、熒光定量反應液、Tap酶。

所述針對鱖魚傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）的特異性引物及探針是根據鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ORF007基因保守區序列設計的。

作為優選的，所述針對鱖魚傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）的特異性引物及探針的序列如下所示：

ISKNV-F: 5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’（SEQ ID NO:1）；

ISKNV-R: 5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’（SEQ ID NO:2）；

ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’（SEQ ID NO:3）。

所述試劑盒中還含有陽性標準品，所述陽性標準品為含有鱖傳染性脾腎壞死病毒DNA的質粒。

一組用于檢測鱖傳染性脾腎壞死病毒的熒光定量PCR特異性引物及探針，序列如下所述

ISKNV -F: 5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’（SEQ ID NO:1）；

ISKNV-R: 5'-CGCCTTTAACGTGGGATATATTG-3’ （SEQ ID NO:2）；

ISKNV-P：5'-FAM-CACCAAACTGACCGCGGACTCGT- Eclipse-3’ （SEQ ID NO:3）。

一種鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步驟：

（1）以鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ORF007基因保守區序列作為PCR擴增的靶序列，設計合成特異性引物和探針；

（2）建立質粒拷貝數與CT值對應關系的標準曲線；

（3）利用步驟（1）的特異性引物和探針對鱖魚傳染性脾腎壞死壞死病毒滴度進行熒光定量PCR檢測，根據檢測CT值，結合標準曲線計算出鱖傳染性脾腎壞死病毒滴度與拷貝數的對應關系。

所述特異性引物和探針的序列如下所示：

ISKNV–F：5'-CGAGGCCACATCCAACATC-3’（SEQ ID NO:1）；