[發明專利]一種利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法

在審

• 申請號: 201410166272.9
• 申請日: 2014-04-23
• 公開（公告）號: CN103952400A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 杜夢涵;李董嬌;惠杜鵑;房欣宜;崔亞麗
• 申請（專利權）人: 西安金磁納米生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 胡樂

技術領域

本發明涉及一種利用磁性納微米材料純化微量組織總核酸的方法。

背景技術

高質量核酸提取是許多分子生物學研究中至關重要的步驟，分子生物學實驗研究對于核酸純度和完整性等方面有較高要求。針對于動物組織的分析，包括疾病診斷、克隆、測序、擴增及雜交等諸多實驗研究的核心是純化得到高質量高濃度的核酸。隨著分子生物學、臨床醫學和藥物基因組學等學科的高速發展，總核酸純化方法應用于腫瘤穿刺組織可實現對于穿刺組織總核酸的快速高效純化，從而為患者的病理診斷、藥物代謝基因研究及個體化用藥研究等奠定基礎。動物組織樣本及人腫瘤穿刺組織樣本通常較難得到，可用于純化的樣本質量較小；目前國內外對于微量組織總核酸純化方法的相關研究較少，因此，關于針對微量組織的總核酸純化方法的研究具有其重要意義。

目前國內外針對于動物組織核酸純化的方法和試劑盒可歸納為兩類：固相分離法和液相分離法。利用磁性微粒進行的核酸分離純化屬于固相分離法的一種，該方法操作簡便、無需使用有毒性的有機試劑、純化過程快速且得到的核酸質量高。OMEGA等公司開發的類似產品可從同一組織中分步得到RNA與基因組DNA，但是不能實現兩者的同時提取，且價格昂貴，實驗結果不穩定，難以得到普遍應用。

專利CN101724625A所涉及的總核酸的磁性微粒分離方法針對于大量組織(≥15mg)效果較好，但針對于微量組織(≤10mg)則不能實現高質量高濃度總核酸的分離純化。

金磁微粒，即組裝型磁性復合微粒及核/殼型超順磁性復合微粒，其制備方法及結構組成已在中國專利ZL03153486.4和ZL03124061.5分別進行了公開，本發明即為基于金磁微粒所建立的快速高效、經濟環保的微量組織總核酸純化方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速高效、經濟環保的基于金磁微粒的微量組織總核酸純化方法，實現微量組織總核酸共同提取。

本發明的技術解決方案是：

一種利用金磁微粒純化動物微量組織中總核酸的方法，其特征在于：整個純化過程在無菌操作臺完成，包括以下步驟：

(1)裂解樣品

取待純化樣本，加入裂解液中，充分研磨至無固體組織存在的勻漿液(研磨組織的方式可根據具體情況選擇，如液氮研磨法或使用自動勻漿機)，加入稀釋液混勻備用；所述裂解液為終濃度為2M‐8M硫氰酸胍溶液與0.01‐0.05M檸檬酸鈉的混合溶液，并在使用前以體積比25:1加入β‐巰基乙醇；

(2)形成含金磁微粒‐核酸復合物的混合溶液

取金磁微粒溶液置于一潔凈離心管中，磁性分離后去除上清液，加入結合液后與步驟(1)得到的勻漿液混合均勻，室溫下靜置使其充分結合，形成含金磁微粒‐核酸復合物的混合溶液；

(3)將金磁微粒‐核酸復合物從混合溶液中分離

對混合溶液磁性分離，棄去管內液體(管內液體因含有組織成分而不澄清，屬于正常情況)，管內的固體成分為所得到的金磁微粒‐核酸復合物；

(4)清洗

依次采用第一清洗液和第二清洗液對收集到的金磁微粒‐核酸復合物進行清洗，其中第一清洗液是終濃度為2M‐8M氯化鋰溶液和50％(V/V)乙醇混合溶液，第二清洗液是70％‐85％(V/V)乙醇；

(5)洗脫

將洗脫液與清洗后的金磁微粒-核酸復合物混合均勻，使DNA與RNA從磁性微粒上洗脫下來，在外加磁場的作用下，將磁性微粒與洗脫下的總核酸分離，收集上清液，即為純化得到的總核酸。

基于上述基本方案，本發明還做如下優化限定和改進：

步驟(1)中的稀釋液為終濃度0.01M‐0.1MTris‐HCl、0.001M‐0.010M?EDTA以及質量分數0.1％‐0.5％SSC和0.2‐0.8％SDS的混合溶液。稀釋液成分可有效地螯合活化核酸酶所需的金屬陽離子，由此抑制核酸酶的活性；同時，稀釋液中含有離子型表面活性劑，可充分去除核蛋白及細胞中的蛋白質雜質。

步驟(2)中的結合液為無水乙醇。在與PEG-8000等多種常用結合液比較之后，無水乙醇的純化效果最佳，不會影響磁粒與勻漿液的結合。

步驟(5)中的洗脫液為無核糖核酸酶水。

待純化樣本的質量≤10mg。