[發明專利]一種發酵種子液的制備方法及豆粕發酵方法

在審

• 申請號: 201410164296.0
• 申請日: 2014-04-23
• 公開（公告）號: CN105087409A
• 公開（公告）日: 2015-11-25
• 發明（設計）人: 柴丹;吳學智;宋鵬
• 申請（專利權）人: 豐益(上海）生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23K1/00;A23K1/14;C12R1/125
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔

技術領域

本發明涉及一種種子液的制備方法及連續化豆粕發酵的方法，屬于生物發酵技術領域。

背景技術

近年來，我國的養殖業有了巨大的發展，對飼料的需求逐年增加。豆粕因含有豐富的蛋白質，是飼料行業中最重要的植物性蛋白源。因豆粕中含有大量的抗營養因子，限制了豆粕的應用，尤其在幼小家畜飼料的使用，眾多研究發現：微生物降解是一種高效、可行的方法。

采用微生物發酵處理，種子液制備工藝是保證產品質量穩定至關重要的一個環節。

目前，對于發酵豆粕工業化生產過程中種子液制備，文獻報道常采用的是菌種復壯后，斜面培養，接入搖瓶在搖床上培養一段時間后，再以一定接種量接入發酵罐，進行放大培養，待種子液成熟后，接入一定含水量豆粕，進行固體發酵；例如：CN101684450B公開了一種飼料預混料的生產工藝，通過對枯草芽孢桿菌兩次擴培后，將發酵液接入豆粕，制得飼料預混料，可添加入多種動物飼料中，顯著促進動物生長、提高飼料轉化率、增加動物免疫功能。又如：吳勝華、李呂木等人研究多菌種固態發酵豆粕生產小肽飼料中，乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等都通過斜面活化后，接入各菌增殖培養基，經搖床或靜置培養48h，再以2％接種量分別接到各菌的發酵種子培養基中，培養24h，制成發酵種子液；為提高豆粕的營養價值，霉菌也常被使用，如：Ilyas,A.M.Hirabayashi，T.Matsui，H.Yano等人用曲霉(Aspergillususami)發酵豆粕，將曲霉接入搖瓶培養3-4d，將孢子懸浮于豆粕混勻，進行固態發酵，去除豆粕中植酸，提高動物對有機磷的吸收利用。

然而傳統發酵豆粕種子液制備過程中，菌種需經斜面活化、搖瓶擴培再進行產業化種子制備，工序繁瑣、流程長、染菌風險大。

另一種是將芽孢菌、酵母菌、乳酸菌、霉菌等一種或幾種微生物制成干粉，先與一定量水(可含一定營養物質)攪拌均勻后，再與豆粕混勻，或將一定量菌粉直接與一定含水量豆粕拌勻，進行固體發酵。例如：CN102823717A將復合發酵菌劑與溫熱潔凈水混合均勻形成復合發酵菌液之后，均勻噴灑在豆粕原料上，經一段時間發酵、干燥后，制得高生物活性發酵豆粕；此種方法成本高、工序更長，菌粉由發酵液經濃縮、冷凍干燥、分裝等制成，設備投入大，對于一些小型企業，難以實現。

目前發酵中使用的發酵菌株在培養過程中，容易發生退化，不能連續進行發酵培養獲得發酵種子液，目前生產中還沒有一種具有良好穩定性的菌株，以達到連續化豆粕發酵，在豆粕發酵過程中，發酵菌株的退化問題是影響豆粕發酵連續化的一個重要問題。

縱觀我國發酵豆粕發展，還處于大規模產業化生產初期，國內大部分廠家采用的都是批次生產，自動化程度低，產品質量參差不齊。總體來說，發酵豆粕產品受到菌株性能、生產設備、市場競爭等諸多因素限制，至今未見連續化生產發酵豆粕的方法。本發明針對現有發酵豆粕種子液制備工藝中發酵菌株容易退化、工藝繁瑣且設備投入大的缺點，提供一種穩定性好的菌株及連續化種子液制備工藝，縮短種子液制備時間，在此基礎上，實現接種、固態培養、干燥、包裝等工序連續化生產，提高生產效率。

發明內容

本發明的第一方面在于，提供一種制備枯草芽孢桿菌B3發酵種子液的方法，方法包括以下步驟：

(1)將枯草芽孢桿菌B3種子液接種至無菌發酵培養基中，發酵培養至發酵液OD₆₀₀到達0.8-1.0；

(2-1)進行流加培養，優選的，流加培養時發酵液的OD₆₀₀為0.8-1.0；或

(2-2)取出部分體積發酵種子液，以獲得枯草芽孢桿菌B3發酵種子液，向保留的種子液中補加無菌發酵培養基，并繼續發酵培養至發酵液OD₆₀₀到達0.8-1.0，

(3)收集獲得枯草芽孢桿菌B3發酵種子液。

在本發明的提供的制備種子液的方法中，在步驟(3)前重復步驟(2-2)1-100次，優選重復2-80次，更優選10-50次。

在本發明的一個實施方案中，步驟(1)所述的種子液為將枯草芽孢桿菌B3于30℃-37℃，100-300rpm下培養14-16h獲得的。

在本發明的一個實施方案中，步驟(1)所述的種子液為使用LB培養基或牛肉膏蛋白胨培養基獲得的。

在本發明的一個實施方案中，步驟(1)中所述的發酵培養為于30-37℃，通氣量3-4vvm，攪拌速度500-600rpm下培養。

在本發明的一個實施方案中，步驟(2-1)中所述流加培養速度為200-500ml/min。