[發明專利]流感病毒RNA聚合酶結晶的方法

在審

• 申請號: 201410162712.3
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN105018441A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發明（設計）人: 劉迎芳
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/866
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，涉及流感病毒RNA聚合酶結晶的方法，尤其涉及一種流感病毒RNA聚合酶復合體的表達、純化及結晶方法。?

背景技術

流感病毒，尤其是甲型流感病毒一直是威脅人類社會的一個大問題，它具有廣泛的宿主范圍包括人、豬、馬和禽類等，可以造成人類及動物上呼吸道感染，即流行性感冒，由于其可以借空氣迅速的傳播，在上個世紀造成數次世界性的大流行。流感病毒屬于正黏病毒科，為負鏈單鏈RNA分節段基因組病毒，其基因組分為8段，目前發現至少可編碼16個蛋白。雖然目前存在不少抗流感病毒藥物和疫苗，但是這些藥物和疫苗主要針對流感病毒表面蛋白，如HA，NA和M2。由于流感病毒在藥物壓力下可以通過突變或者基因重組改變其表面抗原，這些表面蛋白經過突變的毒株將具有抗藥性，從而可能引起無法控制的流感流行。為了解決藥物和疫苗的抗藥性問題，人們在考慮改變思路來研發廣譜性抗流感藥物。?

隨著對流感病毒復制機制的研究，人們逐漸將眼光集中在病毒的核糖核蛋白RNP上。流感病毒RNP是流感病毒復制的核心組分。與病毒表面蛋白不同，流感病毒的RNP更為保守，它由病毒基因組、RNA聚合酶和纏繞在病毒基因組RNA上的多個核蛋白組成，負責病毒的轉錄和復制。流感病毒聚合酶是流感病毒復制的核心機器，它是由PA、PB1和PB2三個亞基組成的大小約為250千道爾頓(KDa)的三元復合物，可以產生三種類型的RNA，分別是cRNA、vRNA和mRNA,該聚合酶在病毒的生命活動中既參與病毒基因組的轉錄復制過程，同時有文章報道該復合物也參與病毒的組裝。?

盡管人們通過生物化學，遺傳學，生物信息學和結構生物學對流感病毒聚合酶進行了各方面的深入研究，提出了越來越精細的模型，關于聚合酶的工作機制方面仍然有很多關鍵問題尚無法解決，例如：聚合酶如何調控轉錄和復制過程；在復制過程中，兩個聚合酶分子如何協調以啟動和終止復制等；此外，聚合酶還參與病毒的組裝和抵御宿主免疫系統。為了解決這些問題，十分需要一個原子分辨率的聚合酶整體結構，然而由于流感病毒聚合酶是一個250KD的復合物，為了以行使其多種功能，可能具有多種構象，這給結構生物學研究、尤其是晶體結構的獲得造成了極大的障礙，因此即使經過了數十年的努力，仍沒有流感病毒聚合酶整體復合物的結構得到報道。?

目前，人們在重組蛋白表達純化，晶體優化和結構解析方面積累了大量的經驗，通常情況下，純化得到足夠量的穩定均一的蛋白質、并由此獲得結晶仍然是大分子晶體結構分析的主要瓶頸。?

發明內容

本發明的目的是提供一種流感病毒RNA聚合酶結晶的方法。?

本發明提供的方法，包括如下步驟：為先將流感病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲細胞中共表達、純化，得到RNA聚合酶，再將所述RNA聚合酶與RNA結合形成復合體，再將所述復合體結晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶體；?

所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基組成；N＝37-280中的任一自然數。?

上述方法中，所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基組成；N＝37-130中的任一自然數。?

上述方法中，所述PB2亞基截短體為如下1)或2)或3)：?

1)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前37位的氨基酸殘基形成的蛋白；?

2)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前130位的氨基酸殘基形成的蛋白；?

3)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前103位的氨基酸殘基形成的蛋白。?

上述方法中，所述昆蟲細胞為High?Five細胞；?

所述流感病毒為A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具體為H5N1、H1N1或H3N2。?

上述方法中，所述將流感病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲細胞中共表達采用Bac-to-BacBac-to-Bac桿狀病毒表達系統，所述Bac-to-BacBac-to-Bac桿狀病毒表達系統中的供體質粒為pFastBac，大腸桿菌為DH10Bac，昆蟲細胞為Sf9。?

上述方法中，所述PB1亞基的氨基酸序列為序列表中序列1所示；?

所述PA亞基的氨基酸序列為序列表中序列3所示；?

所述PB2亞基的氨基酸序列為序列表中序列2所示；?