[發明專利]流感病毒RNA聚合酶結晶的方法

在審

• 申請號: 201410162712.3
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN105018441A
• 公開（公告）日: 2015-11-04
• 發明（設計）人: 劉迎芳
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/866
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種流感病毒RNA聚合酶復合體表達、純化及結晶的方法，為先將流感病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在離體的昆蟲細胞中共表達、純化，得到RNA聚合酶，再將所述RNA聚合酶與RNA結合形成復合體，再將所述復合體結晶，得到流感病毒RNA聚合酶晶體；

所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基組成；N＝37-280中的任一自然數。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述PB2亞基截短體由PB2亞基自N末端起第1至N位氨基酸殘基組成；N＝37-130中的任一自然數。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PB2亞基截短體為如下1)或2)或3)：

1)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前37位的氨基酸殘基形成的蛋白；

2)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前130位的氨基酸殘基形成的蛋白；

3)為PB2亞基氨基酸序列自N末端起前103位的氨基酸殘基形成的蛋白。

4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述昆蟲細胞為High?Five細胞；

所述流感病毒為A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具體為H5N1、H1N1或H3N2。

5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述將流感病毒RNA聚合酶的PB1亞基編碼基因、PA亞基編碼基因和PB2亞基截短體的編碼基因在昆蟲細胞中共表達采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統，所述Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統中的供體質粒為pFastBac，大腸桿菌為DH10Bac，昆蟲細胞為Sf9。

6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述PB1亞基的氨基酸序列為序列表中序列1所示；

所述PA亞基的氨基酸序列為序列表中序列3所示；

所述PB2亞基的氨基酸序列為序列表中序列2所示；

1)所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-37位；

2)所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-130位；

3)所示的所述PB2亞基截短體的氨基酸序列為序列表中序列2自N末端第1-103位。

7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述PB1亞基的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4所示；

所述PA亞基的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6所示；

1)所示的所述PB2亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5’末端第1-111位；

2)所示的所述PB2亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5’末端第1-390位；

3)所示的所述PA亞基截短體的編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列5自5’末端第1-309位。

8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：

所述純化為將共表達得到的所述RNA聚合酶依次經親和層析、離子交換層析和凝膠層析，得到純化后的RNA聚合酶；

所述結晶采用的緩沖液由終濃度為2％-30％的PEG1000-20000、終濃度為50mM-500mMNaCL和濃度為100mM、pH值為8.5的TrisHCL緩沖液組成；

所述結晶采用的溫度為4℃-20℃。

9.由權利要求1-8任一所述的方法制備的RNA聚合酶晶體。

10.權利要求9所述的RNA聚合酶晶體在抗流感病毒藥物篩選或疫苗設計和制備中的應用。