[發明專利]一種水蛭的DNA條形碼分子鑒定方法

有效

• 申請號: 201410162545.2
• 申請日: 2014-04-21
• 公開（公告）號: CN103898235B
• 公開（公告）日: 2017-03-15
• 發明（設計）人: 李振國;陳艷明;務勇圣
• 申請（專利權）人: 牡丹江友搏藥業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及物種鑒定領域，具體涉及一種寬體金線蛭DNA條形碼分子鑒定方法。?

背景技術

寬體金線蛭(學名：Whitmania?pigra)是傳統的名貴中藥材，是2010版《中國藥典》收錄的藥材水蛭主要基原動物之一，具有破瘀通經，消積散結等功效，也是疏血通等眾多治療心臟血管疾病中藥的主要原料。因此，對寬體金線蛭的鑒定是入藥的基礎。在我國的藥材市場，大部分動物藥都是貴重、緊缺藥材，通常以粉末等形式入藥，市場較為混亂，鑒別十分困難。至于水蛭，在藥材市場上，來源相對清晰，但是仍有部分偽品在市場內流通。目前，傳統的性狀鑒別缺乏準確的內部解剖特征或者是在貯藏、加工炮制過程中形態被嚴重破壞，基于形態結構細微差別的歸類描述穩定性差，可信度低，導致水蛭的鑒定存在很大困難，因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統分類方法的缺陷。?

DNA條形碼技術(DNA?Barcoding)是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析，從而快速、準確地進行物種鑒定的技術。目前在動物中最常用的DNA?barcode是細胞色素C氧化酶1號基因(COI)的部分序列。近幾年來，DNA條形碼技術已被證明是一個行之有效的生物鑒定手段，不僅可對傳統鑒定方法作強有力的補充，而且因為其更客觀、準確，突破以往對經驗的過度依賴，能幫助鑒定物種、發現新種和隱種、重建物種和高級階元的演化關系等。運用DNA條形碼技術，可以很好的對水蛭的品種進行快速、有效的鑒定。?

本發明提供一種關于寬體金線蛭DNA條形碼分子鑒定的方法，有利于實現寬體金線蛭的快速準確鑒定，縮短鑒定時間。?

發明內容

本發明克服目前以形態學鑒定水蛭方法存在的缺陷，提高寬體金線蛭鑒定結果的準確度，是一種易于操作、靈敏度高的鑒定方法。本發明的技術方案如下：?

首先從采集的各種水蛭提取總DNA，利用一對引物進行PCR擴增一段COI基因片段，將擴增產物測序，然后進行序列分析比對，建立各種水蛭的序列標準數據庫，在比較數據庫DNA的基礎上，通過分析在特定條件下的聚合酶鏈式反應的產物結果，從而達到快速，準確鑒定寬體金線蛭的目的。對需要鑒定的水蛭樣品，提取其總DNA，在給定的條件下，用設計的特異引物進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳確定PCR擴增產物結果，然后測序，根據?序列比對可以鑒定出寬體金線蛭。本發明設計的用于鑒別寬體金線蛭的分子鑒定方法，采用如下步驟：?

1、提取水蛭總DNA按常規動物DNA提取方法或者血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.1μg/μl-2μg/μl。?

2、擴增DNA片段，進行聚合酶鏈式反應，即用特異的引物進行擴增，引物對序列為?

LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；?

HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；?

擴增程序為94℃預變性1分鐘，45℃退火1.5分鐘，72℃延伸1.5分鐘，5個循環94℃變性1分鐘，50℃退火1.5分鐘，72℃延伸1分鐘，35個循環72℃延伸5分鐘。?

3、將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA?marker檢測PCR片段大小。?

4、鑒定結果的判斷：若出現明顯清晰的709bp大小的條帶，且無雜帶，則可送生物公司測序。?

5、將測序結果進行手工校對、序列拼接，如果與所述基因序列SEQ?ID?NO.1同源性在99％以上，即可判斷所述的待測組織即為寬體金線蛭。?

其中，所述的水蛭DNA條形碼分子鑒定方法采用的是血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒。?

所述引物，正向引物為5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′反向引物為5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。?

所使用的DNA聚合酶為pfu高保真酶。?

所述的電泳為1％-2％的瓊脂糖凝膠電泳。?

所述的條帶大小需要用DNA?maker檢測。?

所述的DNA序列拼接軟件包括CodonCode?Aligner、Sequencher、Genious、DNA?star等軟件。?

與傳統的形態學鑒定方法相比，本發明獲得的基因序列有利于實現寬體金線蛭的分子鑒定。?

附圖說明