[發明專利]一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法

有效

• 申請號: 201410162028.5
• 申請日: 2014-04-21
• 公開（公告）號: CN103898234A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 李振國;陳艷明;務勇圣
• 申請（專利權）人: 牡丹江友搏藥業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及物種鑒定領域，具體涉及地龍的DNA條形碼分子鑒定方法。

背景技術

地龍，即蚯蚓，性寒，味微咸，是傳統的中藥材，而《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)“地龍”項下收載的僅有環節動物門鉅蚓科動物參環毛蚓(Pheretima?aspergillum(E.Perrier))、通俗環毛蚓(Pheretima?vulgaris?Chen)、威廉環毛蚓(Pheretima.guillelmi(Michaelsen))或櫛肓毛蚓(Pheretima?pectinifera?Michaelsen)的干燥體。前一種習稱“廣地龍”，后三種習稱“滬地龍”。地龍在《神農本草經》被列為下品，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功效。常炒制后用于高熱、神昏、驚癇抽搐、關節痹痛、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓等癥。李時珍在《本草綱目》稱之為具有通經活絡、活血化瘀、預防治療心腦血管疾病作用。現代研究表明，地龍含有多種藥理活性成分，藥理作用幾乎涉及人體各個系統，主要有抗血栓、溶栓和平喘、抗心律失常、降壓、增強免疫、抗潰瘍、解熱、消炎、鎮痛、免疫調節、促進創面愈合、鎮靜、抗腫瘤等多方面的藥理作用，臨床應用非常廣泛。

對地龍品種的鑒定是入藥的基礎，目前中藥材地龍的鑒定大多采用的是活體鑒別的方法，主要依據其外部形態和內部構造。但是由于動物類藥材大多外部形態相似，組織特征無特異性，而且經過產地粗加工和飲片炮制后，難以看出物種本身的形狀和顏色，顯微特征也有不同程度的破壞，造成地龍干品鑒別比較困難。因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統分類方法的缺陷。

DNA條形碼技術(DNA?Barcoding)是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析，從而快速、準確地進行物種鑒定的技術。目前在動物中最常用的DNA?barcode是細胞色素C氧化酶1號基因(COI)的部分序列。近幾年來，DNA條形碼技術已被證明是一個行之有效的生物鑒定手段，不僅可對傳統鑒定方法作強有力的補充，而且因為其更客觀、準確，突破以往對經驗的過度依賴，能幫助鑒定物種、發現新種和隱種、重建物種和高級階元的演化關系等。運用DNA條形碼技術，可以很好的對廣地龍和滬地龍的品種進行快速、有效的鑒定。

本發明提供一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法，無形態學觀察，可以快速準確鑒定《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種和非藥材地龍品種，保證中藥原材料的安全性。

發明內容

本發明克服目前以形態學鑒定地龍方法存在的缺陷，提高地龍鑒定結果的準確度，是一種易于操作、靈敏度高的鑒定方法。本發明的技術方案如下：

首先從采集的地龍樣品提取基因組DNA，利用一對引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出樣品一段COI基因，將擴增產物測序，然后進行序列分析比對，建立廣地龍和滬地龍的序列標準數據庫，在比較數據庫DNA的基礎上，通過分析聚合酶鏈式反應的產物結果，根據COI基因序列的差異，從而達到快速、準確鑒定地龍物種的目的。本發明設計的用于《中華人民共和國藥典》規定的地龍品種和非藥材地龍品種鑒定方法，采用如下步驟：

1、提取地龍基因組DNA：按常規動物DNA提取方法或者血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.1μg/μl-2μg/μl。

2、擴增DNA片段，進行聚合酶鏈式反應，即用特異的引物進行擴增，引物對序列為

LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；

HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′：

擴增程序為94℃預變性1分鐘，45℃退火1.5分鐘，72℃延伸1.5分鐘，5個循環94℃變性1分鐘，50℃退火1.5分鐘，72℃延伸1分鐘，35個循環72℃延伸5分鐘。

3、將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNAmarker檢測PCR片段大小。

4、鑒定結果的判斷：若出現明顯清晰的709bp大小的條帶，且無雜帶，則可送生物測序公司測序。

5、將測序結果進行手工校對、序列拼接，如果與所述基因序列SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.4，如果與任一序列同源性在99％以上，即可判斷所述的待測組織即為上述種屬。

其中，所述的地龍DNA條形碼分子鑒定方法采用的是血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒。

所述引物：