[發(fā)明專(zhuān)利]一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410162028.5
• 申請(qǐng)日: 2014-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103898234A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李振國(guó);陳艷明;務(wù)勇圣
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及物種鑒定領(lǐng)域，具體涉及地龍的DNA條形碼分子鑒定方法。

背景技術(shù)

地龍，即蚯蚓，性寒，味微咸，是傳統(tǒng)的中藥材，而《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版(一部)“地龍”項(xiàng)下收載的僅有環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓(Pheretima?aspergillum(E.Perrier))、通俗環(huán)毛蚓(Pheretima?vulgaris?Chen)、威廉環(huán)毛蚓(Pheretima.guillelmi(Michaelsen))或櫛肓毛蚓(Pheretima?pectinifera?Michaelsen)的干燥體。前一種習(xí)稱(chēng)“廣地龍”，后三種習(xí)稱(chēng)“滬地龍”。地龍?jiān)凇渡褶r(nóng)本草經(jīng)》被列為下品，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效。常炒制后用于高熱、神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)痹痛、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓等癥。李時(shí)珍在《本草綱目》稱(chēng)之為具有通經(jīng)活絡(luò)、活血化瘀、預(yù)防治療心腦血管疾病作用。現(xiàn)代研究表明，地龍含有多種藥理活性成分，藥理作用幾乎涉及人體各個(gè)系統(tǒng)，主要有抗血栓、溶栓和平喘、抗心律失常、降壓、增強(qiáng)免疫、抗?jié)儭⒔鉄帷⑾住㈡?zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤等多方面的藥理作用，臨床應(yīng)用非常廣泛。

對(duì)地龍品種的鑒定是入藥的基礎(chǔ)，目前中藥材地龍的鑒定大多采用的是活體鑒別的方法，主要依據(jù)其外部形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造。但是由于動(dòng)物類(lèi)藥材大多外部形態(tài)相似，組織特征無(wú)特異性，而且經(jīng)過(guò)產(chǎn)地粗加工和飲片炮制后，難以看出物種本身的形狀和顏色，顯微特征也有不同程度的破壞，造成地龍干品鑒別比較困難。因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類(lèi)方法的缺陷。

DNA條形碼技術(shù)(DNA?Barcoding)是通過(guò)對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析，從而快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。目前在動(dòng)物中最常用的DNA?barcode是細(xì)胞色素C氧化酶1號(hào)基因(COI)的部分序列。近幾年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)已被證明是一個(gè)行之有效的生物鑒定手段，不僅可對(duì)傳統(tǒng)鑒定方法作強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且因?yàn)槠涓陀^、準(zhǔn)確，突破以往對(duì)經(jīng)驗(yàn)的過(guò)度依賴(lài)，能幫助鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱種、重建物種和高級(jí)階元的演化關(guān)系等。運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)，可以很好的對(duì)廣地龍和滬地龍的品種進(jìn)行快速、有效的鑒定。

本發(fā)明提供一種地龍的DNA條形碼分子鑒定方法，無(wú)形態(tài)學(xué)觀察，可以快速準(zhǔn)確鑒定《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種和非藥材地龍品種，保證中藥原材料的安全性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服目前以形態(tài)學(xué)鑒定地龍方法存在的缺陷，提高地龍鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度，是一種易于操作、靈敏度高的鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

首先從采集的地龍樣品提取基因組DNA，利用一對(duì)引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增出樣品一段COI基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，然后進(jìn)行序列分析比對(duì)，建立廣地龍和滬地龍的序列標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，在比較數(shù)據(jù)庫(kù)DNA的基礎(chǔ)上，通過(guò)分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物結(jié)果，根據(jù)COI基因序列的差異，從而達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒定地龍物種的目的。本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的地龍品種和非藥材地龍品種鑒定方法，采用如下步驟：

1、提取地龍基因組DNA：按常規(guī)動(dòng)物DNA提取方法或者血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，并用滅菌的去離子水將樣品的DNA濃度稀釋到0.1μg/μl-2μg/μl。

2、擴(kuò)增DNA片段，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即用特異的引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物對(duì)序列為

LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；

HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′：

擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性1分鐘，45℃退火1.5分鐘，72℃延伸1.5分鐘，5個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘，50℃退火1.5分鐘，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)72℃延伸5分鐘。

3、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNAmarker檢測(cè)PCR片段大小。

4、鑒定結(jié)果的判斷：若出現(xiàn)明顯清晰的709bp大小的條帶，且無(wú)雜帶，則可送生物測(cè)序公司測(cè)序。

5、將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行手工校對(duì)、序列拼接，如果與所述基因序列SEQ?ID?NO.1-SEQ?ID?NO.4，如果與任一序列同源性在99％以上，即可判斷所述的待測(cè)組織即為上述種屬。

其中，所述的地龍DNA條形碼分子鑒定方法采用的是血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒。

所述引物：