[發(fā)明專利]可在動物細(xì)胞表達分泌的重組葡聚糖酶及其重組方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410161721.0
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN103966188A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳珍芳;張獻偉;李紫聰;劉德武;賀曉燕
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/10;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種可在動物細(xì)胞分泌表達的重組葡聚糖酶，其特征在于，所述重組葡聚糖酶的核苷酸序列為SEQ ID No:1或SEQ ID No:3。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可在動物細(xì)胞分泌表達的重組葡聚糖酶，其特征在于，所述重組葡聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID No:2或SEQ ID No:4。

3.權(quán)利要求1或2所述的可在動物細(xì)胞分泌表達的重組葡聚糖酶的重組方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)對微生物來源的葡聚糖酶基因Bg17A和eg1314的成熟肽區(qū)密碼子進行優(yōu)化，人工去除基因Bg17A和eg1314自身信號肽序列，將SEQ ID No:5所示的豬腮腺蛋白信號肽序列添加到密碼子優(yōu)化后的Bg17A和eg1314基因成熟肽N端進行基因改造，改造后的基因分別為：SEQ ID No:6所示的pBgA和SEQ ID No:7所示的pEGX；

(2)、將改造后的基因5’端和3’端分別添加EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切位點后，克隆到pUC57質(zhì)粒中，再利用EcoRI和XhoI內(nèi)切酶分別酶切，得到含有改造基因的內(nèi)切酶片段，將其克隆到哺乳動物細(xì)胞表達載體pCDNA3.1(+)質(zhì)粒中，分別獲得載體pCDNA-pBgA和pCD-pEGX；

(3)、去除pEGX基因N端PSP信號肽序列，和pBgA基因C端的終子密碼子，借助序列號為SEQ ID No:10的剛性肽A3連接，將pEGX基因連接到pBgA基因C端，并在pEGX基因C末端添加flag-tag標(biāo)簽，得到重組β-葡聚糖酶pBgA3pEG，其核苷酸序列為SEQ ID No:1，氨基酸序列為SEQ ID No:2；

(4)、將步驟(3)獲得的重組葡聚糖酶pBgA3pEG克隆到pCDNA3.1(+)載體中，獲得pCD-pBgA3pEG；以pCD-pBgA3pEG為模板，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12為引物進行第一次擴增得到pBgA-2A；然后以步驟(2)中的載體pCD-pEGX為模板，SEQ ID No:13和SEQ ID No:14為引物進行第二次擴增得到2A-pEGX；

(5)、以SEQ ID No:11和SEQ ID No:14作為引物，以步驟(4)獲得的pBgA-2A和2A-pEGX為模板，進行基因重疊延伸PCR擴增，獲得重組β-葡聚糖酶pBg2ApEG，其核苷酸序列為SEQ ID No:3，氨基酸序列為SEQ ID No:4。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可在動物細(xì)胞分泌表達的重組葡聚糖酶的重組方法，其特征在于，步驟(4)和(5)中所述PCR擴增條件為：98℃10s；60℃5s；72℃10～20s;35個循環(huán)；72℃2min。

5.權(quán)利要求1或2所述的可在動物細(xì)胞分泌表達的重組葡聚糖酶在制備細(xì)胞生物反應(yīng)器或轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。