[發明專利]可在動物細胞表達分泌的重組葡聚糖酶及其重組方法和應用

有效

• 申請號: 201410161721.0
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN103966188A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 吳珍芳;張獻偉;李紫聰;劉德武;賀曉燕
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/10;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

技術領域

本發明技術屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種可在動物細胞表達分泌的重組葡聚糖酶及其重組方法和應用。

背景技術

β-葡聚糖屬于植物細胞壁中的結構性非淀粉多糖，是由β-1，3和β-1，4糖苷鍵連接而成的D型葡萄糖聚合體，分子量大約在6500KDa以上，廣泛存在于高等植物細胞壁中，在大麥、燕麥胚乳細胞壁中含量高，大麥中β-葡聚糖含量約4％-10％。在小麥、黑麥，玉米，高粱，小米中等禾谷類農作物也有一定含量，β-葡聚糖分按其溶解性分為水溶性和非水溶性兩類，其可溶部分可以在動物胃腸道內形成粘性食糜，影響動物內源消化酶擴散，進而影響營養物質消化，不溶解部分是植物細胞壁的主要成分，部分營養物質包埋其中，阻礙消化酶的消化。β-葡聚糖是大麥、燕麥小麥、黑麥，玉米，高粱，小米中主要的抗營養成分。

β-葡聚糖酶(β-glucanase)可以水解大麥、小麥和黑麥等谷物中的β-葡聚糖，催化裂解β-葡聚糖分子中β-1，3-1，4糖苷鍵，降解生成小分子寡糖和葡萄糖。不少研究顯示，豬，禽小麥，大麥基礎日糧中添加β-葡聚糖酶可以提高動物對粗蛋白，能量，AA利用效率，改善動物生產性能，減少畜禽排泄物中的氮、臭氣排放(X.Ao,2010a； Owusu-Asiedu et al.,2012；Willamil et al.,2012)。葡聚糖酶已經成為動物飼料添加劑最常用外源酶制劑，是一類高效、無毒副作用和環保型的“綠色”飼料添加劑。但是這些外源消化酶動物自身不能分泌，一直以來都是先利用微生物發酵獲得相應的酶，在人工添加飼料中，添加到飼料中的添加劑容易受飼料制粒、膨化、貯存等因素影響，且需要不斷添加，效果不理想，成本高。

目前，一大批β-葡聚糖酶(β-glucanase)基因已經在各種細菌，真菌成功克隆出來，如Alicyclobacillus sp.A4CelA4基因(Bai et al.,2010)，Paecilomyces sp.FLH30來源PsBg16A(Hua et al.,2011)基因，(Hua et al.,2011),Bisporasp.MEY-1Bg17基因(Luo et al.,2010),B.licheniformis EGW039eg1314基因(Teng et al.,2006)等。這些基因克隆后，經大腸桿菌或者酵母發酵產酶，根據報道絕大多數酶基因最適pH較窄，在不同pH緩沖液中僅有一個峰，很難適應動物胃腸道pH1.0～7.0持續變化的酸堿環境，在動物胃腸道中僅能在胃或者腸道發揮水解作用，作用時間短，其耐酸堿，耐胃蛋白酶，胰蛋白酶能力參差不齊，其最適作用溫度嚴重偏離動物正常體溫，多分布在40-70℃。飼料制粒溫度多數要求80-95℃，其實際應用中，對酶耐熱能力要求較高，受諸多因素影響，很難選擇理想的酶用于生產。

因此，有必要對β-葡聚糖酶進行改良，以期能適應動物胃腸道環境。

發明內容

基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種可在動物細胞分泌表達的重組葡聚糖酶及其重組方法和應用。

為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：

一種可在動物細胞分泌表達的重組葡聚糖酶，所述重組葡聚糖酶的核苷酸序列為SEQ ID No:1或SEQ ID No:3；所述重組葡聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID No:2或SEQ ID No:4。

本發明還提供了上述重組葡聚糖酶的重組方法，包括以下步驟：

(1)對微生物來源的葡聚糖酶基因Bg17A和eg1314的成熟肽區密碼子進行優化，人工去除基因Bg17A和eg1314自身信號肽序列，將SEQ ID No:5所示的豬腮腺蛋白信號肽序列添加到密碼子優化后的Bg17A和eg1314基因成熟肽N端進行基因改造，改造后的基因分別為：SEQ ID No:6所示的pBgA和SEQ ID No:7所示的pEGX；

(2)、將改造后的基因5‘端和3’端分別添加EcoRI和XhoI限制性內切位點后，克隆到pUC57質粒中，再利用EcoRI和XhoI內切酶分別酶切，得到含有改造基因的內切酶片段，將其克隆到哺乳動物細胞表達載體pCDNA3.1(+)質粒中，分別獲得載體pCDNA-pBgA和pCD-pEGX；