[發明專利]一種食源性致病菌DNA的階段控溫快速提取方法

在審

• 申請號: 201410161363.3
• 申請日: 2014-04-22
• 公開（公告）號: CN104059906A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 熊曉輝;熊麗莎;陸利霞;程月花;游京晶
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/445;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，具體涉及食源性致病菌DNA的快速提取方法。

背景技術

食品安全問題一直是各國政府和人民群眾最為關心的問題，由食源性致病菌引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。在HACCP體系的建立和實施過程中，致病性病原微生物一直是各類食品加工行業控制的重點。

食源性致病菌是引起細菌性食物中毒的病原菌。食源性致病菌多達幾十種，主要有金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，志賀氏菌和副溶血性弧菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌、肉毒桿菌等。食源性致病菌對人體健康的影響主要是指微生物本身及其代謝過程、代謝產物對食品原料、加工過程和產品的污染，這種污染會對食品消費者的健康造成損害。

傳統的食源性致病菌的分離培養檢測方法檢測周期長，需要4-7d，且操作步驟繁瑣、特異性差。因此建立快速、靈敏、準確的檢測技術來檢測食源性致病菌顯得尤為重要，聚合酶鏈式反應(PCR)等分子生物學檢測技術因其特異性和靈敏度高而被廣泛采用。而PCR檢測技術的第一步就是模板DNA的制備，即樣品中DNA的提取，直接影響著PCR反應的結果。長期以來，樣品中DNA的提取和純化一直是耗時、繁瑣的過程，嚴重減慢了檢測速度。因此，建立一種快速的DNA提取 方法對提高PCR檢測效率起著至關重要的作用。

本技術領域所熟知的DNA提取方法主要有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、試劑盒方法等。CTAB方法提取的DNA純度，為1.8左右，應用較廣泛，但其操作步驟繁瑣，長達8步，且實驗過程中用到苯酚氯仿等有毒試劑，而試劑盒方法因其提取的DNA純度高達1.8-2.0，是目前應用最為廣泛的一種方法，但其操作耗時長達1-2h。

發明內容

本發明的目的在于解決現有DNA提取耗時長、步驟多的難題，提供了一種快速提取食源性致病菌DNA的方法，且提取的DNA質量滿足后續檢測方法要求，從而加快了食源性致病菌的檢測速度，以便更好地為食源性疾病的預防和控制提供幫助。

本發明的技術方案是按以下步驟進行：

(a)取食品樣品10-25g(mL)或致病菌菌株至適宜液體培養基制備培養液，然后取1-5mL細菌培養液，8000-12000rmp離心1-4min，使細菌細胞沉淀，棄上清；

(b)往步驟(a)制得的的菌體沉淀中加入100-500uL無菌雙蒸水，充分混合，8000-12000rmp離心1-4min，棄上清；

(c)往步驟(b)制得的細菌沉淀中加入100-500uL細胞裂解液，懸浮細菌沉淀，并于105℃-126℃油浴10s-3min；

(d)將步驟(c)所得的混合液移至70℃-95℃水浴5-30min；

(e)步驟(d)結束后，8000-12000rmp離心1-4min取上清，上清液即為模板DNA，對提取所得DNA進行質量檢測，剩余DNA于-20℃保 存備用。

現有技術中的DNA提取方法耗時長達數小時，本發明方法綜合運用了水浴及油浴進行階段控溫，通過裂解液裂解細胞，從而快速的獲取DNA，整個提取過程不到40min，簡單有效。本方法不需要特別的實驗儀器及試劑，成本相對較低。使用本方法提取的DNA樣品濃度在50-400ng/uL，所得的DNA純度即OD260/OD280的比值為1.6-1.8.且所得的DNA質量可以滿足普通PCR、熒光PCR、環介導等溫擴增等檢測方法的要求。

表1金黃色葡萄球菌DNA濃度及純度

表2乙型副傷寒沙門氏菌DNA的濃度和純度

表3牛奶中單核增生李斯特菌DNA的濃度及純度

附圖說明

圖1：金黃色葡萄球菌DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖1中，M為15000bp Maker；1，2，3為105℃油浴10s，70℃水浴5min。

圖2：金黃色葡萄球菌DNA的PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2中，M為2000bp Maker，1-3分別對應圖1中1-3。

圖3：乙型副傷寒沙門氏菌DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3中，M為15000Maker；1，2，3為110℃油浴60s，70℃水浴30min。

圖4：乙型副傷寒沙門氏菌DNA的PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4中，M為15000Maker；1-3分別對應圖3中1-3。