[發明專利]蓖麻蠶蛹做生物反應器制備重組人表皮生長因子的方法

在審

• 申請號: 201410160406.6
• 申請日: 2014-04-21
• 公開（公告）號: CN104073518A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 黃元姣;小林淳;伍玉婷
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C07K14/485;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 吳彥峰

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組桿狀病毒做基因表達載體制備重組人表皮生長因子的方法。

背景技術

人表皮生長因子(human?epidermal?growth?factor，hEGF)是由53個氨基酸組成的多肽，分子量約為6000Da，其生物學功能使其在制藥和化妝品領域具有廣泛的應用。人表皮生長因子具有促進上皮再生的功能，可以用于促進外科手術傷口及其它創面的愈合，如皮膚移植、皮膚的擦傷、燒傷、糜爛等；還具有促進角膜上皮細胞的增殖的作用，用來治療角膜損傷、潰瘍以及促進移植角膜的存活；還能抑制胃酸分泌，可用于消化性潰瘍的治療；還能加快表皮更新，使表皮細胞個體年齡年輕化，起到護膚、抗皺、美白等美容效果，可用于化妝品領域。因而，獲得類似天然重組人表皮生長因子具有重要的經濟價值。

人表皮生長因子曾在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和家蠶桿狀病毒中成功地表達，但利用蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組桿狀病毒做基因表達載體制備重組人表皮生長因子的方法未見有報道。蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組桿狀病毒做基因表達載體的方法屬真核細胞基因表達方法，具有蛋白質翻譯后修飾過程，表達效率高，表達產物的生物學特性與天然產物相似等優勢。

廣西是唯一的蓖麻蠶保種基地，擁有成熟的蓖麻蠶飼養技術和豐富的木薯葉飼料資源。利用蓖麻蠶繭殼加工蠶絲綿、蠶蛹做生物反應器的新用途，對提升蓖麻蠶的經濟價值，促進廣西的養蠶事業發展具有重要意義。所用蠶蛹具有廉價，可儲存，運輸方便，無須飼養或細胞培養，可機械化操作等優點。

發明內容

本發明的發明目的在于：提供一種以蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組桿狀病毒做基因表達載體制備重組人表皮生長因子的方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：通過基因工程技術將入門載體pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的載體線性化AnpeNPV?DNA核多角體基因啟動子下游，獲得表達載體重組柞蠶桿狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV?DNA，所述表達載體經處理后接種蓖麻蠶蛹，高效表達HCEGF，經孵育、分離純化制備出功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子；其中：

（1）所述入門載體的構建方法為：

用Nco?Ⅰ/EcoR?Ⅰ雙酶切消化HCEGF/pET-28a質粒，獲得擁有從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA結束的完整閱讀框架（orf）、且N端附有6xHis的6xHis-HCEGF基因片段，將該基因片段插入到Nco?Ⅰ/EcoR?Ⅰ雙酶切過的pENTR^TM4Dual質粒的Nco?Ⅰ和EcoR?Ⅰ之間，獲得入門載體pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF，使6xHis-HCEGF片段位于質粒中的attL1和attL2之間；

（2）所述目的載體的構建方法為：

提取柞蠶桿狀病毒AnpeNPV?DNA，通過DNA同源同組技術在AnpeNPV?DNA的核多角體基因啟動子下游插入由AvrⅡ酶切位點相連的attR1和aatR2序列構建目的載體AnpeNPV，抽提AnpeNPV?DNA并通過AvrⅡ酶切線性化；

（3）所述表達載體的構建方法為：

取所述入門載體pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF150ng、目的載體線性化AnpeNPVDNA150ng、5×LR克隆酶混合物2μl、pH8.0TB緩沖液混合至10μl，25℃溫浴1-16小時；pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGFDNA與線性化AnpeNPV?DNA在LR克隆酶作用下進行重組，生成表達載體重組柞蠶桿狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV?DNA。

（2）所述表達載體接種蓖麻蠶蛹前的處理方法為：

用所述重組柞蠶桿狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV?DNA接種柞蠶宿主AnPe細胞，27℃培養1周后收取上清表達載體病毒液并反復擴大培養后進行斑點形成法測定感染力PFU和-80℃保存備用。

進一步地，所述孵育的溫度是27℃，孵育時間為1周。

進一步地，所述分離純化首先是對孵育后的蠶蛹進行研磨，然后收集上清液，再進行硫酸銨沉淀和Ni-NTA?Agrose親和層析分離純化，最終得到功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子。

綜上所述，由于采用了上述技術方案，本發明的有益效果是：