[發明專利]蓖麻蠶蛹做生物反應器制備重組人表皮生長因子的方法

在審

• 申請號: 201410160406.6
• 申請日: 2014-04-21
• 公開（公告）號: CN104073518A
• 公開（公告）日: 2014-10-01
• 發明（設計）人: 黃元姣;小林淳;伍玉婷
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C07K14/485;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 吳彥峰

1.蓖麻蠶蛹做生物反應器制備重組人表皮生長因子的方法,其特征在于：通過基因工程技術將入門載體pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的載體線性化AnpeNPV?DNA核多角體基因啟動子下游，獲得表達載體重組柞蠶桿狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV?DNA，所述表達載體經處理后接種蓖麻蠶蛹，高效表達HCEGF，經孵育、分離純化制備出功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子；其中：

（1）所述入門載體的構建方法為：

用NcoⅠ/EcoRⅠ雙酶切消化HCEGF/pET-28a質粒，獲得擁有從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA結束的完整閱讀框架（orf）、且N端附有6xHis的6xHis-HCEGF基因片段，將該基因片段插入到Nco?Ⅰ/EcoR?Ⅰ雙酶切過的pENTR^TM4Dual質粒的NcoⅠ和EcoR?Ⅰ之間，獲得入門載體pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF，使6xHis-HCEGF片段位于質粒中的attL1和attL2之間；

（2）所述目的載體的構建方法為：

提取柞蠶桿狀病毒AnpeNPV?DNA，通過DNA同源同組技術在AnpeNPV?DNA的核多角體基因啟動子下游插入由AvrⅡ酶切位點相連的attR1和aatR2序列構建目的載體AnpeNPV，抽提AnpeNPV?DNA并通過AvrⅡ酶切線性化；

（3）所述表達載體的構建方法為：

取所述入門載體pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGF150ng、目的載體線性化AnpeNPVDNA150ng、5×LR克隆酶混合物2μl、pH8.0TB緩沖液混合至10μl，25℃溫浴1-16小時；pENTR^TM4Dual-6xHis-HCEGFDNA與線性化AnpeNPV?DNA在LR克隆酶作用下進行重組，生成表達載體重組柞蠶桿狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPVDNA；

（4）所述表達載體接種蓖麻蠶蛹前的處理方法為：用所述表達載體重組柞蠶桿狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV?DNA接種柞蠶宿主AnPe細胞，27℃培養1周后收取上清表達載體病毒液并反復擴大培養后進行斑點形成法測定感染力PFU和-80℃保存備用。

2.根據權利要求1所述的蓖麻蠶蛹做生物反應器制備重組人表皮生長因子的方法,其特征在于：所述孵育的溫度是27℃，孵育時間為1周。

3.根據權利要求2所述的蓖麻蠶蛹做生物反應器制備重組人表皮生長因子的方法,其特征在于：所述分離純化首先是對孵育后的蠶蛹進行研磨，然后收集上清液，再進行硫酸銨沉淀和Ni-NTA?Agrose親和層析分離純化，最終得到功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子。