[發(fā)明專利]一種積累高絲氨酸的ε?聚賴氨酸的發(fā)酵方法

有效

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• 申請日: 2014-04-18
• 公開（公告）號: CN104004796B
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賈士儒;宋慶超;郭鳳柱;譚之磊;馮伏龍;薄濤
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12P13/02
• 分類號: C12P13/02;C12R1/525
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司12209
• 代理人: 趙瑤瑤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及ε-聚賴氨酸(ε-PL)的生產(chǎn)方法，尤其是一種積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

ε-PL是由放線菌產(chǎn)生的含有25-35個L-Lys殘基的同聚物，這些L-Lys殘基通過α-羧基和ε-氨基連接。ε-PL抑菌譜較為廣泛，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌以及霉菌等均有不同程度的抑制作用。對于大部分細(xì)菌，其最小抑菌濃度(MIC)為1-8g/L(核實數(shù)據(jù))；而對于酵母菌和真菌，其MIC稍微偏高一些。500mg/L可使非收縮性長尾噬菌體失活。ε-PL能在人體內(nèi)分解為L-Lys(八種必需氨基酸之一)，而后者也是各國允許在食品中強(qiáng)化的氨基酸之一。因此，ε-PL是一種營養(yǎng)型抑菌劑，安全性高于化學(xué)防腐劑，同時，考慮其安全性和生物可降解性，1989年日本批準(zhǔn)其用于加工食品中，隨后韓國和美國也允許其作為食品添加劑使用。2004年1月，美國食品和藥品管理局(FDA)認(rèn)定ε-PL是“一般認(rèn)為安全的”(Generally Recognized as Safe，GRAS)。2010年，F(xiàn)DA發(fā)布了關(guān)于ε-PL通過GRAS認(rèn)證的公告，公告中指出，在特定的條件下ε-PL可作為食品防腐劑應(yīng)用于各類傳統(tǒng)食品。

早在1977年，日本的Shima and Sakai發(fā)現(xiàn)了S.albulus NBRC 14147能夠合成ε-PL。之后，有很多關(guān)于提高ε-PL產(chǎn)量的報道。Hirohara等人在2006年發(fā)表的文章中報道，在USE-51發(fā)酵過程中，以恒定的速率向培養(yǎng)基中補(bǔ)充甘油，可以提高產(chǎn)酸水平，并且維持pH的穩(wěn)定性。他們對菌株USE-11和USE-51產(chǎn)ε-PL的過程進(jìn)行研究，添加TCA循環(huán)中的有機(jī)酸，檸檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸和蘋果酸，發(fā)現(xiàn)檸檬酸能大幅提高ε-PL的產(chǎn)量，琥珀酸則完全抑制ε-PL的合成，α-酮戊二酸和蘋果酸對USE-11和USE-51產(chǎn)酸的影響介于兩者之間。這種現(xiàn)象可能是由于檸檬酸鹽能促進(jìn)草酰乙酸轉(zhuǎn)化生成L-天冬氨酸，而L-天冬氨酸的積累導(dǎo)致L-賴氨酸的大量合成。α-酮戊二酸對發(fā)酵過程中的影響表明，TCA循環(huán)可能會分形成L-谷氨酸鹽，以致于這些物質(zhì)能與L-天冬氨酸-β-半乳糖結(jié)合，生成二氨基庚二酸中間體(圖1)。蘋果酸對發(fā)酵的影響表明，這種有機(jī)酸能夠提高L-天冬氨酸和L-谷氨酸的合成。Shima等認(rèn)為L-Lys分子能夠直接被ε-PL生物合成所利用。因此，Hirohara等人在USE-51的發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基成分包含有檸檬酸、甘油和(NH₄)₂SO₄時，向培養(yǎng)基中添加11mM的L-lysine，能夠大幅度提高ε-PL的產(chǎn)量。

經(jīng)檢索，找到如下關(guān)于ε-PL生產(chǎn)的專利文獻(xiàn)，具體公開內(nèi)容為：

1、大量生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的菌株和生產(chǎn)方法(CN1260004)公開了一種較常規(guī)的提高菌株產(chǎn)ε-PL的生產(chǎn)能力以及大規(guī)模生產(chǎn)ε-PL的方法。

2、一種誘變菌株白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株生產(chǎn)ε-聚賴氨酸及其鹽的方法(CN101285046)公開了一種用紫外誘變、紫外和化學(xué)誘變相結(jié)合，以及N離子注入誘變等手段誘變白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株生產(chǎn)ε-聚賴氨酸及其鹽的方法。

3、一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法(CN102352385A)公開了采用甘油作碳源，結(jié)合兩階段pH值調(diào)控策略和流加發(fā)酵方法生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。

4、一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法(CN102352386A)公開了采用葡萄糖和甘油共同作為碳源，結(jié)合流加發(fā)酵方法和pH控制策略生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。

5、一種提高ε-聚-L-賴氨酸產(chǎn)量的新方法(CN101671703)公開了利用葡萄糖作碳源并流加L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL。

6、一種ε-聚-L-賴氨酸的生產(chǎn)方法(CN102363797A)公開了通過在發(fā)酵過程中添加甘氨酸，甘氨酸可進(jìn)入葉酸代謝途徑，為生物合成過程提供充足的一碳基團(tuán)，提高菌株合成代謝活力，增加前體L-賴氨酸及ε-聚-L-賴氨酸的合成，使ε-聚-L-賴氨酸積累量比原有工藝提高了20～50％。

7、一種促進(jìn)ε-聚賴氨酸合成的方法(CN103333926A)公開了通過在ε-聚賴氨酸發(fā)酵過程中分批或連續(xù)流加所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸鈉固體或溶液，實現(xiàn)ε-聚賴氨酸產(chǎn)量顯著提高。