[發明專利]一種食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的評估方法

有效

• 申請號: 201410155825.0
• 申請日: 2014-04-18
• 公開（公告）號: CN103898230A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 易欣欣;劉一倩;范雙喜;陳湘寧;劉超杰;高秀芝;王曉東
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/19;C12R1/42;C12R1/445;C12R1/01
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技術領域

本發明屬于葉類蔬菜生產過程中產品安全領域，具體地說，涉及一種食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的評估方法。?

背景技術

隨著人們健康觀念的加強，新鮮蔬菜的消費量不斷增加。研究表明，多吃蔬菜可以減少罹患慢性非傳染性疾病的風險。但在消費量增加的同時，新鮮蔬菜引起的微生物性食源性疾病也快速增長。例如，在美國70年代蔬果引起的微生物食物中毒不足1％，到90年代上升為6％。在中國，新鮮蔬果引起的致病微生物食源性疾病鮮有報道。這可能是由于以下原因：(1)我國的食物中毒的漏報率高；(2)中國人生食蔬菜的品種和比例遠遠低于歐美人；(3)我國蔬菜生產中所使用的化學品比例較高，一定程度上抑制了病原菌的生長、繁殖；(4)許多較輕的食物中毒現象被忽視了；(5)我們的監控系統還不完善，覆蓋率較低。?

食品安全問題越來越為廣大民眾所關注，中國食品安全評估中心認為我國的食品安全排位前三的風險分別為：(1)致病微生物引起的食源性疾病；(2)農藥等化學性污染；(3)人為添加非法添加劑。?

隨著生活節奏的加快和生活方式的改變，近年來中國居民生食蔬菜的比例也在逐年上升。致病微生物引起的食源性疾病的潛在風險也同樣提高。葉類蔬菜營養價值高，新鮮度好，以其莖葉為主要可食部分，是中國人的主要消費蔬菜品種，但因其表面積大、水分含量高、易于破損、不耐儲存而容易攜帶食源性致病微生物。?

在國外由于蔬菜攜帶的致病微生物引起食源性疾病不斷增加，相應的也進行了廣泛的研究，其中蔬菜生產過程中的食源性致病微生物侵染是一個重要方?面。但迄今為止，并沒有一個簡單易行的規范方法來評估食源性致病微生物侵染蔬菜的能力，以及蔬菜抵御食源性致病微生物侵染的能力。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其步驟包括：(1)使消毒后葉類蔬菜種子萌芽；(2)選擇無污染的萌芽種子接種到植物培養基上培養至2-3cm；(3)接種食源性致病微生物至小苗上，接種方式為根部接種或整株接種；(4)根據評估目的確定PCR檢測細菌16SrDNA的時點，評估侵染內化和遷移是針對根部接種培養苗，檢測時間為接種后培養2-15天；評估殘存是針對整株接種培養苗，檢測時間為接種后2-30天；(5)用食源性致病微生物的特異性基因驗證16SrDNA的陽性結果。?

所述消毒是指蔬菜種子清水洗滌干凈、浸泡后，選適當消毒劑消毒一定時間，所述消毒劑為乙醇、次氯酸鈉、1000萬單位農用鏈霉素300-500倍液、1％高錳酸鉀、10％磷酸三鈉、1％硫酸銅、福爾馬林100倍液等的一種或幾種。所述種子萌芽是指用無菌水沖凈消毒后種子放入0.5％-0.8％瓊脂培養皿中(含葡萄糖0.2％-0.5％)；每皿20-30粒，一定溫度下發芽(20℃一28℃)，待種子發芽。所述無污染指萌芽種子中沒有細菌和真菌污染的發芽種子。將萌芽種子放入組培瓶中，每瓶3-6粒；光照培養一定時間后，可根據需求以不同方式接入不同種類、不同濃度的食源性致病微生物；接入食源性致病微生物后，再培養一定時間，隨后檢測蔬菜不同部位的食源性致病微生物的存在情況，以評估某種蔬菜與某種食源性致病微生物的相關性。?

所述食源性致病微生物包括沙門菌、大腸桿菌O157：H7、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等致病細菌。所述食源性致病微生物菌種的制備方法是指將菌株分別在營養瓊脂培養基上活化后，挑取單菌落，接種營養肉湯培養?基，37℃培養16小時，制成接種用菌懸液備用，其濃度為10³／mL至10⁸／mL。?

所述蔬菜為生菜、油菜、大白菜、甘藍、菠菜、芹菜、快菜、茼蒿等可以種子發芽的葉類蔬菜。?

所述PCR檢測細菌的16SrDN?A是指常規PCR檢測細菌的16SrDN?A的方法，所用引物為27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’，將其作為致病菌陽性指標，為防止檢測過程雜菌污染，可以用不同致病菌的特異基因序列作為驗證指標。?

所述致病微生物的特異性基因包括：?

沙門氏菌選擇(引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp)引物擴增的基因序列：?

Salmonella?enterica?subsp.?

Gene=″fimY″?

NCBI?Reference?Sequence：NC_003197.1?