[發(fā)明專利]一種食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的評估方法

有效

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• 申請日: 2014-04-18
• 公開（公告）號: CN103898230A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 易欣欣;劉一倩;范雙喜;陳湘寧;劉超杰;高秀芝;王曉東
• 申請（專利權(quán)）人: 北京農(nóng)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/19;C12R1/42;C12R1/445;C12R1/01
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• 代理人: 暫無信息

1.一種評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其步驟包括：(1)使消毒后葉類蔬菜種子萌芽；(2)選擇無污染的萌芽種子接種到植物培養(yǎng)基上培養(yǎng)至2-3cm；(3)接種食源性致病微生物至小苗上，接種方式為根部接種或整株接種；(4)根據(jù)評估目的確定PCR檢測細(xì)菌16SrDNA的時點，評估侵染內(nèi)化和遷移是針對根部接種培養(yǎng)苗，檢測時間為接種后培養(yǎng)2-15天；評估殘存是針對整株接種培養(yǎng)苗，檢測時間為接種后2-30天；(5)用食源性致病微生物的特異性基因驗證16SrDNA的陽性結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其特征在于，所述消毒采用乙醇、次氯酸鈉、1000萬單位農(nóng)用鏈霉素300-500倍液、1％高錳酸鉀、10％磷酸三鈉、1％硫酸銅、福爾馬林100倍液的一種或幾種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其特征在于，所述種子萌芽是指用無菌水沖凈消毒后種子放入0.5％一0.8％重量瓊脂培養(yǎng)皿中，其中含葡萄糖重量0.2％一0.5％；每皿20一30粒，20℃一28℃條件下，待種子發(fā)芽。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其特征在于，所述食源性致病微生物包括沙門菌、大腸桿菌O157：H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其特征在于所述蔬菜為生菜、油菜、大白菜、甘藍(lán)、菠菜、芹菜、快菜、茼蒿。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其特征在于，所述PCR檢測細(xì)菌的16SrDN?A是指常規(guī)PCR檢測細(xì)菌的16SrD?N?A的方法，所用引物為27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’，將其作為致病菌陽性指標(biāo)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的評估食源性致病微生物侵染葉類蔬菜的方法，其特征在于，所述致病微生物的特異性基因包括：

沙門氏菌，引物1：ACCACGCAGGGAAAGACA，引物2：GCCCAGCCATACGGATAA425bp，引物擴(kuò)增的基因序列：

ATGCGCAGCGTACCACGCAGGGAAAGACACCGCCGTTTAAGAAATGCTAAAGACTGCGCCTGCCGTTATCACTCTCCAACGCCGCAGATATTTGATCGCCTTGAGTTACTGAACCAACAGCTCAATTATGCCTTGCCGGTTGGTATCATTTCTCAGGCAATAATTACAACTGACAACTACCTCGGCTATTCATTGAGTCACTACTTATTTTCCGGAAAACGTACCGCAGCATTCCGCTCATTAGATGACATTTCTTTGTGGATTGAAAAGGGGTCGCTCAGACAACTGATTGTAGATATGGAGGCGCTACCTGTCTCCTGTATTGAGGCGCTTAACCAGCTACGCGCGCTCAGTTGGCAACAAAGCGATATCCAGATTTACCTGCTGGTATCAGATAAAACCTCCGCTATAACACAGTTTATCCGTATGGCTGGGCGTTTTTTTGTCCTGTCGCGACGACAAAATCTGGCCTCAGTACGCGAAGCCTTGTTATCAGCCTCCAAACCTCGCTTATCGGAAAGCTTTAGCCGTACTGACTGGTTGATGATTGAAACTTTAGCGCAAGGCGCCTCTTTAAAAGAAATAGCACGTCAGCAAAGCGTACCTTATCATCGTGTAGTTTACCGGCTTAAACAACTTATCACCCTCCTTAACCTTCCCCACAGGCAAAGCTTTCTTCGGCTGATCCAGCAGCTAAACGTTACTTTCCACGACATTTTTTAA；

大腸桿菌O157：H7，引物EOflicl：GCGCAGCTAAAGCTGATATG，EOflic2：TTAACCCTGCAGCAGAGACA779bp，引物擴(kuò)增的基因序列：

ATGGCACAAGTCATTAATACCAACAGCCTCTCGCTGATCACTCAAAATAATATCAACAAGAACCAGTCTGCGCTGTCGAGTTCTATCGAGCGTCTGTCTTCTGGCTTGCGTATTAACAGCGCGAAGGATGACGCCGCAGGTCAGGCGATTGCTAACCGTTTTACTTCTAACATTAAAGGCCTGACTCAGGCGGCCCGTAACGCCAACGACGGTATTTCTGTTGCGCAGACCACCGAAGGCGCGCTGTCCGAAATCAACAACAACTTACAGCGTATTCGTGAACTGACGGTTCAGGCCACTACAGGGACTAACTCCGATTCTGACCTGGACTCCATCCAGGACGAAATCAAATCTCGTCTTGATGAAATTGACCGCGTATCCGGCCAGACCCAGTTCAACGGCGTGAACGTGCTGGCGAAAGACGGTTCAATGAAAATTCAGGTTGGTGCGAATGACGGCGAAACCATCACGATCGACCTGAAAAAAATCGATTCTGATACTCTGGGTCTGAATGGCTTTAACGTAAATGGTAAAGGTACTATTACCAACAAAGCTGCAACGGTAAGTGATTTAACTTCTGCTGGCGCGAAGTTAAACACCACGACAGGTCTTTATGATCTGAAAACCGAAAATACCTTGTTAACTACCGATGCTGCATTCGATAAATTAGGGAATGGCGATAAAGTCACAGTTGGCGGCGTAGATTATACTTACAACGCTAAATCTGGTGATTTTACTACCACTAAATCTACTGCTGGTACGGGTGTAGACGCCGCGGCGCAGGCTGCTGATTCAGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTGCCACCCTTCATGCTGATGTGGGTAAATCTGTTAATGGTTCTTACACCACAAAAGATGGTACTGTTTCTTTCGAAACGGATTCAGCAGGTAATATCACCATCGGTGGAAGCCAGGCATACGTAGACGATGCAGGCAACTTGACGACTAACAACGCTGGTAGCGCAGCTAAAGCTGATATGAAAGCGCTGYTCAAAGCAGCGAGCGAAGGTAGTGACGGTGCCTCTCTGACATTCAATGGCACAGAATATACCATCGCAAAAGCAACTCCTGCGACAACCACTCCAGTAGCTCCGTTAATCCCTGGTGGGATTACTTATCAGGCTACAGTGAGTAAAGATGTAGTATTGAGCGAAACCAAAGCGGCTGCCGCGACATCTTCAATTACCTTTAATTCCGGTGTACTGAGCAAAACTATTGGGTTTACCGCGGGTGAATCCAGTGATGCTGCGAAGTCTTATGTGGATGATAAAGGTGGTATCACTAACGTTGCCGACTATACAGTCTCTTACAGCGTTAACAAGGATAACGGCTCTGTGACTGTTGCCGGGTATGCTTCAGCGACTGATACCAATAAAGATTATGCTCCAGCAATTGGTACTGCTGTAAATGTGAACTCCGCGGGTAAAATCACTACTGAGACTACCAGTGCTGGTTCTGCAACGACCAACCCGCTTGCTGCCCTGGACGACGCAATCAGCTCCATCGACAAATTCCGTTCTTCCCTGGGTGCTATCCAGAACCGTCTGGATTCCGCAGTCACCAACCTGAACAACACCACTACCAACCTGTCCGAAGCGCAGTCCCGTATTCAGGACGCCGACTATGCGACCGAAGTGTCCAACATGTCGAAAGCGCAGATCATTCAGCAGGCCGGTAACTCCGTGCTGGCAAAAGCTAACCAGGTACCGCAGCAGGTTCTGTCTCTGCTGCAGGGTTAA；

單核細(xì)胞增生李斯特菌，hlyF：CGAGCCTAACATATCCAG，hlyR：

GTAAGCCATTTCGTCATC，272bp，引物擴(kuò)增的基因序列：

ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTTAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTATAAAGATGGAAATGAATATATCGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGATATCCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACATATCCAGGTGCTCTCGTGAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCCGATGTTCTTCCTGTCAAACGTGATTCATTAACACTTAGCATTGATTTGCCAGGAATGACTAATCAAGACAATAAAATTGTTGTAAAAAATGCTACTAAATCGAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCAAAATTTGGTACGGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCATATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTGACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGTGGCTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGACGGTAACCTCGGAGACTTACGAGATATTTTGAAAAAAGGTGCTACTTTTAACCGGGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCCTATACAACAAACTTCTTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATCAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATCTCTTGGGATGAAATAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCAGGTAACGCAAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGACCGGAACCTACCGCTTGTGAAAAATAGAAATATCTCCATCTGGGGCACTACACTTTATCCGAAATATAGTAATAGTGTAGATAATCCAATCGAATAA；

金黃色葡萄球菌，引物nucF：AATCATACGGGTCCTTTC，nucR：CAATGTTCTACCATAGCG297bp，引物擴(kuò)增的基因序列：

ATGAAGTCAAATAAATCGCTTGCTATGATTGTGGTAGCCATCATTATTGTAGGTGTATTAGCATTTCAATTTATGAATCATACGGGTCCTTTCAAAAAGGGGACGAATCATGAAACTGTAGAAGATTTAAATGGTAAAGATAAAGTACATGTTCAAAGAGTTGTGGATGGTGATACATTTATTGCAAATCAAAATGGTAAAGAAATTAAAGTTAGGCTTATAGGGGTTGATACGCCAGAAACGGTGAAACCGAATACGCCTGTACAACCATTTGGCAAAGAAGCATCAAATTATAGTAAGAAGACATTAACAAATCAAGATGTTTATTTAGAATATGATAAAGAAAAACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGCGTATGTATGGATAAGTAAAGATCGTATGTACAATAAGGAATTAGTGGAAAAGGGACTTGCTAGAGAGAAGTATTTTTCACCAAATGGCAAATATAGAAATGTATTTATAGAAGCACAAAATAAAGCTAAACAACAGAAATTAAATATTTGGAGTAAATAA。