[發明專利]一種利用不同水解條件制備具有穩定的功能性的酪蛋白酶解物的方法

有效

• 申請號: 201410154727.5
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN103923964A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 孔祥珍;葉挺;華欲飛;張彩猛;陳業明;孫靈湘
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種利用不同的水解溫度、酶底比組合制備具有特定功能性質的水解產物的方法，屬于酪蛋白水解技術加工領域。

背景技術

蛋白酶是屬于水解酶的一種，它主要是水解蛋白質與多肽的肽鍵。根據酶的來源，蛋白酶可以分成動物來源蛋白酶，植物來源蛋白酶，微生物來源蛋白酶。根據催化的位置的不同，蛋白酶可以分為內肽酶與外肽酶。內肽酶是如今使用較多的酶，內肽酶又可以根據作用的活性位點的不同分為絲氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，金屬蛋白酶和天冬酰胺蛋白酶這四種。人類早在幾百年前就使用蛋白酶，典型的例子是中國的發酵豆制品。近些年來，蛋白酶由于其眾多的優點，越來越被使用在工業生產與實驗研究當中。人們越來越多的使用蛋白酶水解各類蛋白質，以期改善其結構與功能，如改善大豆蛋白的乳化性、起泡性、溶解性等；或者制備某些具有如抗氧化性、降血壓等特殊生理功能的多肽物質。這些研究往往都是建立在研究不同的酶對某一底物，或者某一種酶對多種底物的作用，水解不同的時間或者達到不同的水解度，以獲得優化的水解條件或經優化的水解度。

對于酪蛋白，眾所周知，它是奶液遇酸后所生成的一種蛋白聚合體。酪蛋白約占牛奶中蛋白總量的80%，約占其質量的3%?，也是奶酪的主要成分。酪蛋白是等電點為pH4.6的兩性蛋白質，是牛乳腺分泌的多種(約20種)磷蛋白(phosphoproteins)的混合物，在牛奶中以磷酸二鈣、磷酸三鈣或兩者的復合物形式存在，構造極為復雜。作為牛乳中一種含量高，構象靈活的混合蛋白質，酪蛋白易被蛋白酶水解，其水解產物主要包括肽、少量氨基酸、糖、維生素等。這些產物具有抗菌抗病和調節胃腸吸收等生理功能，在特定條件下還能促進動物細胞體外增殖、增強產物表達，因此，越來越多的研究者將酪蛋白作為一種酶解底物來制備具有功能性質的多肽。如制備具有抗氧化性的酪蛋白磷酸肽、具有降血壓功能的多肽、易被人體吸收的多肽和促進腸道有益菌群的生長繁殖多肽等。

另外東北農業大學食品學院鄭麗娜與張蘭威研究發現，堿性蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽的最佳水解條件為：底物濃度15%、?酶濃度800μ/g、?pH?9.0、溫度55℃、時間2.5h。而蔡為榮與薛正蓮堿性蛋白酶水解酪蛋白制備酪蛋白磷酸肽的最佳工藝條件：底物濃度10%、用酶量1500μ/g、反應溫度45℃、pH10.5、反應時間150min。這些研究者均采用堿性蛋白酶和酪蛋白來制備酪蛋白磷酸肽，但獲得的最佳制備條件卻差異較大。如何在不同酶解條件下獲得性質穩定的酶解物顯得頗為重要。

在工業生產中，產品的穩定性更為重要。對于一個既定的酶解系統，影響該過程的主要因素有五個，即：反應溫度（T），底物濃度（S），pH，酶底比（E/S），水解度（DH）或水解時間（t）。Alder-Nissen采用了pH-stat法來控制堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白反應過程的pH，在較低的水解度下測定其水解產物的性質，研究不同的水解條件如溫度，pH，酶底比和底物濃度對水解產物性質的影響。但在工業生產中，想要完全控制這五個水解條件是存在一定難度的，并且由于生產條件的限制，生產批次的不同往往不能夠保證每次的水解條件都一樣。因此，在有彈性的生產條件下，獲得穩定功能與性質的水解產物是相當重要的。

目前針對該方面的研究不多，本發明希望能夠為工業生產作指導，以在不同的溫度-酶底比組合下都能夠獲得具有穩定功能性質的酶解產品。

發明內容

本發明的目的是提供一種可在不同的水解條件下制備具有穩定的功能與性質的酪蛋白水解產物的制備方法。

本發明的技術方案，以酪蛋白為原料，選擇在不同的水解條件下水解，控制其水解，在每一個水解條件下均得到水解度為5%，10%及15%的水解產物。使得在同一水解度下，不同條件得到的水解產物的三氯乙酸（TCA）可溶性氮含量，DPPH清除率分別都不呈現顯著性差異（P<0.05），具體來說，所得酪蛋白酶解物粉末性質是穩定的。其步驟為：

（1）配制酶解底物：取酪蛋白，用10-15倍質量的蒸餾水溶脹，采用0.5M?的NaOH溶液調節pH值至8.5±0.1，直至pH值恒定，再用蒸餾水定量，使酪蛋白的最終質量濃度為4%-8%，即得酶解底物；

（2）酶解：取步驟（1）制備的酶解底物置于酶反應器中，控制溫度為40-60℃，進行循環水浴5min；將堿性蛋白酶加入酶解底物中，使酶與底物蛋白質量比為1%-3%；酶解過程中，通過加入堿溶液來維持反應的pH為8.5±0.1；

（3）滅酶：當水解度達到5%-15%中的一個固定值時，95oC加熱10min滅酶；