[發明專利]一種熒光素酶?多抗原融合蛋白以及蛋白A瓊脂糖?融合蛋白?抗體復合物

有效

• 申請號: 201410154456.3
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN103969234B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 唐東起;李世武;吳琦;蘇紅霞
• 申請（專利權）人: 山東東興匯智生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/533
• 代理公司: 濟南信達專利事務所有限公司37100
• 代理人: 羅文曌

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，具體地說是一種可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法。

背景技術

一般的，I型糖尿病是一種自體免疫疾病，機體受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素誘發而產生異常自身體液和細胞免疫應答，導致胰島β細胞損傷，胰島素分泌減少，一旦發病需要依賴外源性胰島素補充以維持生命，所以I型糖尿病又稱胰島素依賴性糖尿病。

此類糖尿病常見于兒童和青年患者，但是它可以在任何年齡段的人群中發生，并且此類糖尿病的患病率約占總糖尿病病例的10%。可見及早地對I型糖尿病進行診斷以及高危人群中進行預報具有重要的意義。

對糖尿病的診斷主要通過檢測其自身免疫性抗體，抗體主要包括以下幾種：谷氨酸脫羧酶抗體（GADA）、胰島細胞抗體（ICA）、酪氨酸磷酸酶抗體（IA-2a、IA-2b）及胰島素自身免疫性抗體(IAA)。目前測定GADA、IA-2A、IAA常用的方法有放射免疫法、酶聯免疫法；用于ICA測定的主要用間接免疫熒光法，另外也有用酶聯免疫法及免疫組化法。

ELISA技術（enzyme-linked immuno sorbent assay酶聯免疫吸附測定）對于酶的活性和靈敏度要求很高，其特異性取決于抗原制備的優劣；且其結合物制備尚未標準化，這使得實驗結果的可重復性不高，需要進行多次檢測。另外，若抗原及酶結合物濃度低，最后吸光度值太小，易出現假陰性。多數國家的臨床檢測已放棄ELISA法，使用放射免疫法（RIA法）。

放射免疫分析具有許多其它分析方法無可比擬的優點。它既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，并且樣品用量少，常可測至皮摩爾量。但本方法有時會出現交叉反應、假陽性反應、組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶和鹽，有時會影響結果等。

發明內容

本發明的技術任務是解決現有技術的不足，提供一種快速簡便、準確率高的，并可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法。

本發明的技術方案是按以下方式實現的，該可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特征在于：將熒光素酶基因與多抗原基因融合成融合載體，所述多抗原采用能夠免疫應答產生I型糖尿病的病人血清中自身免疫性抗體的抗原，

然后利用細胞轉化技術，將融合載體導入哺乳細胞系統中，進行熒光素酶—多抗原融合蛋白的表達；裂解基因重組細胞，獲得熒光素酶-多抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反應，將熒光素酶-多抗原融合蛋白稀釋液與病人血清混合進行特異性結合，獲得融合蛋白-抗原-抗體復合物，再加入蛋白A瓊脂糖捕捉融合蛋白-抗原-抗體復合物；加入熒光素酶底物，檢測熒光強度。

可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，包括以下步驟：

A、熒光素酶基因與多抗原基因的融合載體的構建

a、選取熒光素酶基因和多抗原基因的目的序列（GAD65抗原基因序列、IA-2a抗原基因序列、IA-2b抗原基因序列和insulin抗原基因序列），進行PCR擴增，在kpnl位點（GGTACC）引入限制性內切酶，獲得目的片段，做凝膠電泳進行鑒定；

b、將獲得的目的片段與PA0815載體質粒分別進行kpnl和xbal雙酶切，并使用T4連接酶將目的基因與載體基因連接得到重組質粒；

B、質粒轉化

將重組質粒轉入制備好的感受態哺乳細胞系統中，在氨芐耐藥基因平皿中篩選陽性克隆，從轉化細胞內提取質粒DNA，然后質粒DNA進行PCR鑒定及kpnl和xbal雙酶切鑒定；

C、融合蛋白的獲取

挑取單菌落至含有8%～15% I型糖尿病的病人血清的DMEM培養液中27℃～31℃下培養50～60h，于0～4℃，6000～8000rpm離心15～20min；將得到的細胞沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌并離心2～3次，最后將收獲的細胞在冰浴中超聲處理15～30 min，然后將細胞裂解液于0～4℃，最大轉速離心15～45 min后取上清液；

D、重組融合蛋白的純化

把步驟C所得上清液，用硫酸銨沉淀法進行分級沉淀，沉淀物經0.05～0.08 mol/L Tris-Hcl緩沖液沖洗2～3次，后凍干備用；

E、將步驟D所得融合蛋白用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0 PBS磷酸鹽緩沖液進行一定倍數的梯度稀釋得融合蛋白稀釋液，要求融合蛋白稀釋液每微升中有10⁷～10⁸個熒光單位；