[發(fā)明專利]一種熒光素酶?多抗原融合蛋白以及蛋白A瓊脂糖?融合蛋白?抗體復(fù)合物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410154456.3
• 申請(qǐng)日: 2014-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN103969234B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐東起;李世武;吳琦;蘇紅霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東東興匯智生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N33/533
• 代理公司: 濟(jì)南信達(dá)專利事務(wù)所有限公司37100
• 代理人: 羅文曌

1.可同時(shí)檢測(cè)四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特征在于：將熒光素酶基因與多抗原基因融合成融合載體，所述多抗原采用能夠免疫應(yīng)答產(chǎn)生I型糖尿病的病人血清中自身免疫性抗體的抗原，然后利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，將融合載體導(dǎo)入哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中，進(jìn)行熒光素酶—多抗原融合蛋白的表達(dá)；裂解基因重組細(xì)胞，獲得熒光素酶-多抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反應(yīng)，將熒光素酶-多抗原融合蛋白稀釋液與病人血清混合進(jìn)行特異性結(jié)合，獲得融合蛋白-抗體復(fù)合物，再加入蛋白A瓊脂糖捕捉融合蛋白-抗體復(fù)合物；加入熒光素酶底物，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可同時(shí)檢測(cè)四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、熒光素酶基因與多抗原基因的融合載體的構(gòu)建

a、選取熒光素酶基因和多抗原基因的目的序列：GAD65抗原基因序列、IA-2a抗原基因序列、IA-2b抗原基因序列和insulin抗原基因序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在kpnl位點(diǎn)GGTACC引入限制性內(nèi)切酶，獲得目的片段，做凝膠電泳進(jìn)行鑒定；

b、將獲得的目的片段與PA0815載體質(zhì)粒分別進(jìn)行kpnl和xbal雙酶切，并使用T4連接酶將目的基因與載體基因連接得到重組質(zhì)粒；

B、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中，在氨芐耐藥基因平皿中篩選陽(yáng)性克隆，從轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)提取質(zhì)粒DNA，然后質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定及kpnl和xbal雙酶切鑒定；

C、融合蛋白的獲取

挑取單菌落至含有8%～15% I型糖尿病的病人血清的DMEM培養(yǎng)液中27℃～31℃下培養(yǎng)50～60h，于0～4℃，6000～8000rpm離心15～20min；將得到的細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌并離心2～3次，最后將收獲的細(xì)胞在冰浴中超聲處理15～30 min，然后將細(xì)胞裂解液于0～4℃，最大轉(zhuǎn)速離心15～45 min后取上清液；

D、重組融合蛋白的純化

把步驟C所得上清液，用硫酸銨沉淀法進(jìn)行分級(jí)沉淀，沉淀物經(jīng)0.05～0.08 mol/L Tris-Hcl緩沖液沖洗2～3次，后凍干備用；

E、將步驟D所得融合蛋白用0.01～0.02mol/L，pH7.0～8.0 PBS磷酸鹽緩沖液進(jìn)行一定倍數(shù)的梯度稀釋得融合蛋白稀釋液，要求融合蛋白稀釋液每微升中有10⁷～10⁸個(gè)熒光單位；

F、向離心管中加入50μL～80μL的融合蛋白稀釋液，然后加入80～140 μL 預(yù)處理好的實(shí)驗(yàn)組的病人血清，在室溫下，讓I型糖尿病自身抗體與抗原特異性結(jié)合3～5h；

G、再加入2～8 μL蛋白A瓊脂糖，來(lái)捕捉融合蛋白-抗體復(fù)合物，0℃～4℃緩慢搖動(dòng)融合蛋白-抗體復(fù)合物過(guò)夜或室溫緩慢搖動(dòng)1～2h，使抗體與蛋白A瓊脂糖偶連得到蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體復(fù)合物；

H、免疫沉淀反應(yīng)后，在0℃～4℃以3000 rpm 速度離心3～5 min，將蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體復(fù)合物離心至管底；將上清小心吸去，沉淀用磷酸鹽緩沖液將蛋白A瓊脂糖-抗體復(fù)合物懸起離心洗滌2～5次；

I、用10～40 μL 磷酸鹽緩沖液將蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體復(fù)合物懸起后，加入20～100 μL 熒光素酶底物，立即用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，判斷血清樣品中是否含有I型糖尿病自身抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可同時(shí)檢測(cè)四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特征在于所述多抗原基因采用能夠表達(dá)對(duì)應(yīng)：

能夠免疫應(yīng)答I型糖尿病的谷氨酸脫羧酶GAD65抗體、酪氨酸磷酸酶IA-2a抗體、酪氨酸磷酸酶IA-2b抗體和胰島素自身IAA抗體的四種抗體的GAD65抗原、IA-2a抗原、IA-2b抗原和insulin抗原的四種抗原基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的可同時(shí)檢測(cè)四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特征在于所述：

GAD65抗原基因序列是：SEQ ID NO.1 ；

IA-2a抗原基因序列是：SEQ ID NO.2 ；

IA-2b抗原基因序列是：SEQ ID NO.3 ；

insulin抗原基因序列是：SEQ ID NO.4 。