[發明專利]一種PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410154403.1
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN103923898A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 倪曄;張龍;劉夢晗;司海明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;A61P35/00
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

本發明涉及一種PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶，包括對重組蛋白精氨酸脫亞胺酶（ADI）的PEG化修飾方法及其修飾產物的體內外活性研究，還包括PEG化修飾方法的優化，修飾酶的體內外穩定性和腫瘤治療方面的研究應用，屬于醫藥生物工程技術領域。

背景技術

精氨酸脫亞胺酶（arginine?deiminase，EC?3.5.3.6，簡稱ADI）是一種極具潛力的用于治療精氨酸缺陷型腫瘤的抗癌新藥，包括目前尚缺乏有效藥物的肝細胞瘤（hepatocellular?carcinomas，簡稱HCCs）以及黑素瘤（melanomas）。正常細胞所需精氨酸可經體內的尿素循環由精氨琥珀酸合成酶（argininosuccinate?synthetase，ASS）與精氨琥珀酸裂合酶（argininosuccinate?lyase，ASL）共同作用催化瓜氨酸而生成。而精氨酸是生物體內合成絕大部分多肽及蛋白質的重要氨基酸。對于一些腫瘤細胞，因其缺少ASS而自身無法正常合成精氨酸，因此必須從外部環境中攝取精氨酸從而進行生長繁殖，這一類細胞被稱之為精氨酸營養缺陷型腫瘤細胞，例如肝癌細胞和黑素瘤細胞。

肝細胞瘤是世界第五大人類常見癌癥，全世界每年約有60萬人死于肝細胞癌。在中國，肝癌死亡率位居腫瘤死因第2位。其高死亡率的原因在于HCC易轉移、易復發、診斷不及時和治療手段不徹底等。肝癌患者在確診后沒有經過治療其生存期平均為1-4個月。通過手術治療HCC效果不佳，且術后易復發，因此臨床上迫切需要一種治療肝癌的新方法。

ADI應用于癌癥治療最近二十年來為人們所廣泛關注并接受。2002年，Ensor等發現在大腸桿菌中重組表達的支原體ADI對精氨酸營養缺陷型的23種人的黑素瘤以及16種人的肝細胞瘤在體外和體內都具有活性，通過對ADI進行聚乙二醇（PEG）化提高了ADI在體內的半衰期。2004年，他們將ADI-PEG-20用于肝癌的臨床實驗，結果成功使患者血漿中的精氨酸的可檢測濃度降為零。目前，美國鳳凰公司開發的支原體來源的ADI-PEG-20制劑用于肝細胞癌和黑素瘤（藥品名稱分別為Hepacid和Melanocid）的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗正在全球多個中心進行。

本研究室通過篩選得到一株具有較高ADI活性的變形假單胞菌（P.?plecoglossicida）CGMCC?No.2039，對該ADI編碼基因進行克隆和重組表達，并對重組ADI進行蛋白質工程改造以改善其酶活和酶學性質（包括Km和最適pH等），獲得了多個更適合于生理中性條件的ADI突變株。為進一步解決ADI蛋白在體內半衰期短的問題，本發明對ADI突變株進行PEG修飾，以獲得在體內具有更高穩定性和持久半衰期的ADI-PEG酶。

發明內容

本發明的目的是提供具有良好的抗腫瘤活性，延長半衰期的PEG修飾的精氨酸脫亞胺酶。主要針對精氨酸脫亞胺酶在體內半衰期短的問題，提供一種新的精氨酸脫亞胺酶修飾酶ADI-PEG。

本發明的技術方案：本發明所涉及的精氨酸脫亞胺酶為來源于變形假單胞菌（P.?plecoglossicida）CGMCC?No.2039，在中國專利200710107822.X?“一株產精氨酸脫亞氨酶的菌種及其應用”?中已公開。精氨酸脫亞胺酶在大腸桿菌中進行重組表達。

一種PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶，采用PEG修飾劑修飾大腸桿菌中重組表達的精氨酸脫亞胺酶ADI突變株，得到PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶ADI-PEG；其中ADI突變株M314的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示；ADI突變株M13的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示；ADI突變株M13-1的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示；ADI突變株M13-2的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示；ADI突變株M13-3的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示；ADI的基因全長1,254bp，編碼417個氨基酸，單個ADI亞基的分子量為46.5?kDa，重組精氨酸脫亞胺酶由2個或4個相同的ADI亞基組成。

所述ADI-PEG為ADI亞基與5-15個PEG分子的共價結合物；分別命名為ADI-SS-PEG₂₀，ADI-SC-PEG₂₀，ADI-SPA-PEG₂₀；具有30%-70%的平均修飾率。