[發明專利]一種PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410154403.1
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN103923898A
• 公開（公告）日: 2014-07-16
• 發明（設計）人: 倪曄;張龍;劉夢晗;司海明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;A61P35/00
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶，其特征在于：采用PEG修飾劑修飾大腸桿菌中重組表達的精氨酸脫亞胺酶ADI突變株，得到PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶ADI-PEG；其中ADI突變株M314的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示；ADI突變株M13的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示；ADI突變株M13-1的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示；ADI突變株M13-2的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示；ADI突變株M13-3的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示；ADI的基因全長1,254bp，編碼417個氨基酸，單個ADI亞基的分子量為46.5?kDa，重組精氨酸脫亞胺酶由2個或4個相同的ADI亞基組成。

2.根據權利要求1所述PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶，其特征在于：所述ADI-PEG為ADI亞基與5-15個PEG分子的共價結合物；分別命名為ADI-SS-PEG₂₀，ADI-SC-PEG₂₀，ADI-SPA-PEG₂₀；具有30%-70%的平均修飾率。

3.根據權利要求1所述PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶，其特征在于：所述PEG修飾劑為mPEG-SS_20?kDa，SS為琥珀酰亞胺琥珀酸酯；mPEG-SC_20?kDa，SC為琥珀酰亞胺碳酸酯；mPEG-SPA_20?kDa，SPA為琥珀酰亞胺丙酸酯；所述PEG修飾劑的平均分子量為20000?Da。

4.權利要求1所述PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶的制備方法，其特征在于步驟為：

（1）重組ADI粗酶液的制備：取重組表達精氨酸脫亞胺酶的大腸桿菌發酵液離心后收集菌體，用10-500mmol/L、pH?6-8的磷酸鈉緩沖液洗滌2次，按濕菌體重量︰緩沖液重量比為1︰2-20加入緩沖液重懸，在冰浴條件下進行超聲破碎15min，將破碎液離心，所得上清液即為重組ADI粗酶液；

（2）重組ADI的純化：

a、HiTrap^TM?DEAE?FF陰離子交換層析：使用HiTrap^TM?DEAE?FF陰離子交換層析柱，平衡液為10-100mmol/L、pH?6.0-8.0?PBS緩沖液，洗脫液為10-100?mmol/L、pH?6.0-8.0磷酸鈉緩沖液，其中含NaCl?0.1-1.0?mol/L；

洗脫采用線性梯度洗脫方法，NaCl初始濃度為0，終濃度0.1-1.0?mol/L；確定目的蛋白峰，收集蛋白樣品；

b、Superdex^TM?200凝膠過濾層析：采用Superdex^TM?200凝膠預裝柱進行純化，使用10-100mmol/L、pH?6.0-8.0?PBS緩沖液，其中含NaCl?0.05-0.5?mol/L；

取步驟a所得蛋白樣品上樣500μL，洗脫1.0-3.0個柱體積，確定目的蛋白峰并收集，得到重組ADI純酶液；

（3）PEG修飾反應：用10-50mmol/L?PBS緩沖液調整步驟（2）所得重組ADI純酶液濃度為0.1-1.0mg/mL、pH?6.0-10.0；按照摩爾比1︰30-120分別加入三種PEG修飾劑，即mPEG-SS_20?kDa，mPEG-SC_20?kDa，mPEG-SPA_20?kDa，于室溫下攪拌反應1-4?h；將反應液加入100kDa的超濾管中，4000?r/min冷凍離心，每隔10?min加入10-100mmol/L?PBS、pH?6.0-8.0進行濾洗，重復3-5次以除去游離PEG分子，即得產品PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶ADI-PEG。

5.權利要求1所述PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶的應用，其特征在于：所得到的ADI-SS-PEG₂₀，ADI-SC-PEG₂₀，ADI-SPA-PEG₂₀，與未修飾的ADI相比，修飾酶體外酶活穩定性良好，在小鼠血漿中穩定性顯著提高。

6.根據權利要求5所述PEG修飾的重組精氨酸脫亞胺酶的應用，其特征在于：所述ADI-SPA-PEG₂₀在15?U的注射劑量下對H₂₂肝癌表現出95%以上的抑制率。