[發明專利]一種用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫檢測方法

有效

• 申請號: 201410154389.5
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN103954749A
• 公開（公告）日: 2014-07-30
• 發明（設計）人: 孫遠明;劉鳳銀;徐振林;沈玉棟;雷紅濤;王弘;楊金易;肖治理
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;C07K14/795;C07K14/77;C07K14/765;C07K16/44
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明屬于食品安全免疫檢測技術領域，更具體地，涉及一種用于直接檢測呋喃它酮代謝物AMOZ的快速免疫檢測方法。

背景技術

AMOZ是硝基呋喃類抗生素呋喃它酮的代謝物，是非法使用硝基呋喃類抗生素的指示物，是一類具有潛在致畸、致癌和致突變的物質。歐盟已于1995年禁止在食用動物中使用硝基呋喃類抗生素，又在1997年將所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物，我國亦于2002年頒布了禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令。之后歐盟又于2003年通過了2003/181/EC委員會決議，建立了用于禽肉產品和水產品中硝基呋喃類藥物代謝物的各種檢測方法的最小要求性能限值為1μg/kg。現在，為保證食品安全，國內外的監管機構將注意力集中在了AMOZ的檢測上，建立快速、簡單、廉價、有效的AMOZ檢測方法已刻不容緩。

????目前國內外檢測AMOZ的方法主要有色譜方法及其聯用技術、分光光度法、免疫分析法等。前兩種屬于儀器分析檢測技術，存在著周期長、專業性強、費用高等不足，很難適應許多場合快速檢測的需要，在應用上不能廣泛推廣。而現在報道的基于抗原—抗體特異性結合檢測AMOZ的免疫分析方法在檢測之前均需對檢測對象進行衍生化處理，存在著前處理操作復雜繁瑣、成本高及回收率偏低等不足，限制了其應用。

????基于抗原-抗體識別的免疫分析技術在小分子化學性污染物檢測領域占有重要地位，已經成功應用于農藥、獸藥、生物毒素等的快速檢測，為保障食品安全發揮了重要作用。但是，大量實踐證明：當化合物（半抗原）的分子量<300?Da時，其高特異性高親和力的抗體制備難度增大。由于AMOZ分子量很小(201.22?Da)，即使將其與載體蛋白偶聯，其高特異性高親和力抗體的制備難度也相對很大，因此，目前關于AMOZ免疫分析檢測技術的報道大都是需對其進行衍生化的間接檢測，而關于直接檢測AMOZ的免疫分析檢測技術則鮮有報道。

????2009年，Pimpitak?等人報道了一種檢測強化蝦樣品中AMOZ殘留量的方法。他們將AMOZ與3-羧酸苯甲醛衍生化制備免疫半抗原CPAMOZ，通過抗原制備、動物免疫以及單克隆抗體制備獲得單克隆抗體，該抗體雖然能夠識別AMOZ，但是識別靈敏度低，比其對半抗原CPAMOZ的靈敏度低23倍。基于該抗體他們建立了間接檢測AMOZ的免疫分析方法，即在檢測前對其進行衍生化（將AMOZ與2-硝基苯甲醛衍生化為NPAMOZ），衍生化的時間需要十多個小時，十分費時。

????抗體是免疫分析的核心試劑，本課題組以一種新型的AMOZ半抗原，將其與載體蛋白偶聯制備人工抗原，并進行抗體制備，獲得了特異性識別AMOZ的抗體。同時為了提高對AMOZ分析的靈敏度，設計了一個與免疫半抗原不同結構的包被半抗原，基于此建立了一種異源免疫分析方法，該方法可以實現對AMOZ的直接檢測，無需衍生化，同時只對AMOZ的原型呋喃它酮有交叉（CR=188.2%），與其它硝基呋喃類抗生素的原型及其衍生物無交叉現象，考慮到樣品前處理采用水提的方式，呋喃它酮本身不能溶于水，對實際樣品的檢測影響不大，不會造成假陽性，可以用于實際樣品的檢測。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服傳統的AMOZ免疫分析技術中均需對其進行衍生化處理的缺陷，提供一種AMOZ半抗原、人工抗原和高特異性抗體。

????本發明的第二個目的是提供所述AMOZ半抗原、人工抗原和特異性抗體的制備方法。

????本發明的第三個目的是提供一種可以對AMOZ進行直接快速檢測的免疫分析方法。

????本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

一種AMOZ半抗原，所述AMOZ半抗原具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子結構：

?

所述AMOZ半抗原的制備方法為：將AMOZ和乙醛酸或順丁烯二酸酐分別溶于無水乙醇中，攪拌過程中將乙醛酸或順丁烯二酸酐的乙醇溶液滴加到AMOZ的乙醇溶液中，AMOZ和乙醛酸或順丁烯二酸酐的摩爾比為1：1.2；室溫攪拌過夜，反應結束，真空抽濾，依次用乙醇和乙醚洗滌2次，取沉淀、干燥獲得式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示AMOZ半抗原。

一種AMOZ人工抗原，所述AMOZ人工抗原具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子結構：

?

優選地，本發明所述人工抗原的制備方法為：采用活潑酯偶聯法將如上具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）所示分子結構的AMOZ半抗原與載體蛋白偶聯制備得到具有式（Ⅲ）或式（Ⅳ）所示分子結構的AMOZ人工抗原。