[發(fā)明專利]一種檢測HPV的試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410154175.8
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN103898241A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林金明;林雪霞;劉全利;李海芳
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京聿宏知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;歐穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測人乳頭瘤病毒（HPV）的試劑盒。

背景技術(shù)

人乳頭瘤病毒(Human?Papillomavirus,HPV）屬于乳多空病毒科的乳頭瘤病毒A屬，能引起人類皮膚和黏膜組織的多種良性乳頭狀瘤或疣，可導(dǎo)致組織的異常增生，某些亞型感染還具有潛在的致癌性。分子流行病學(xué)研究說明HPV的持續(xù)感染是導(dǎo)致子宮頸癌的必要條件。從1976年開始發(fā)現(xiàn)4種HPV病毒至今，已經(jīng)陸續(xù)鑒定出130多種不同的亞型，有近40種可以特異性地感染生殖器，其中20多種與宮頸腫瘤相關(guān)。根據(jù)致病力的危險程度，可將不同的亞型分為低危型HPV、高危型HPV和潛在高危型HPV，其中HPV16的致癌率最高。Richard?Roden等人在2006年的研究統(tǒng)計(jì)表明在世界范圍內(nèi)，高達(dá)53.5%的宮頸癌病例與HPV16的感染息息相關(guān)。

傳統(tǒng)宮頸癌篩查的標(biāo)準(zhǔn)是對宮頸病理組織或者脫落細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢查，但這一方法的靈敏度有所欠缺，特別是在診斷上皮內(nèi)瘤樣病變CIN2/3中存在漏檢；另外，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測還要求操作人員有相當(dāng)成熟的經(jīng)驗(yàn)，減少發(fā)生主觀誤判。目前，理想的HPV特異性標(biāo)志物是癌蛋白，但在實(shí)際應(yīng)用中，癌蛋白的含量極低，難以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確快速的檢測。隨著基因科學(xué)的發(fā)展，HPV基因型的分析包括利用HPV的DNA和RNA進(jìn)行分析，不僅能夠較為精準(zhǔn)的分析出不同的亞型，還能極大的提高分析的準(zhǔn)確度，減少誤判。因此，使用細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV分型檢測的方法進(jìn)行篩查在宮頸癌篩查過程中逐漸發(fā)展起來。目前，關(guān)于商品化的HPV基因檢測主要引進(jìn)國外產(chǎn)品，并且在國內(nèi)仍處在研究階段。

目前，一般采用RT-PCR法或核酸序列擴(kuò)增法對病毒的mRNA進(jìn)行的擴(kuò)增檢測。雖然此方法在國外已經(jīng)開發(fā)出相關(guān)檢測方法和儀器，但是該方法需要高精密度的儀器和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作過程，價格較高，不利于在廣大欠發(fā)達(dá)地區(qū)推廣普及應(yīng)用。

因此，針對目前流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)中易感HPV的mRNA開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的HPV的基因檢測試劑盒，能夠結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢查對宮頸癌及其癌前病變進(jìn)行篩查，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種檢測HPV的試劑盒，其特征在于，包括如下組分，

1）等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：所述等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中包含RNA反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于擴(kuò)增HPV的引物、擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、金屬離子溶液、還原劑溶液、dNTP和NTP；

2）芯片毛細(xì)管電泳緩沖液：所述芯片毛細(xì)管電泳緩沖液中包含分離緩沖液、染料和甲酰胺。

其中，RNA反轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶；RNA聚合酶是以一條DNA鏈或RNA鏈為模板、以三磷酸核糖核苷酸為底物、通過形成磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶；RNA酶H是一種能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈，但不能消化單鏈或雙鏈DNA和獨(dú)立的RNA的核糖核酸內(nèi)切酶。

在一個具體實(shí)施例中，所述引物選自用于檢測HPV16型的引物，且所述引物的序列為如上游引物SEQ?ID?NO:1和下游引物SEQ?ID?NO:2所示的序列。

在一個具體實(shí)施例中，所述RNA反轉(zhuǎn)錄酶選自AMV反轉(zhuǎn)錄酶，RNA聚合酶選自T7RNA聚合酶。

在一個具體實(shí)施例中，在組分1）的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述RNA反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于擴(kuò)增HPV的引物、擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、金屬離子溶液、還原劑溶液、dNTP、NTP和DMSO可以任意組合為一種或多種溶液；但優(yōu)選地為RNA反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶和RNA酶H組合為一種溶液E-I，而組分1）中其余成份組合成另一種溶液S-II。

在一個具體實(shí)施例中，組分2）的芯片毛細(xì)管電泳緩沖液可以任意組合為一種或多種溶液，但優(yōu)選地組合為一種溶液B-III。

在本發(fā)明中，將各種溶液在反應(yīng)體系中的使用濃度分別定義為1×，舉例來說，如果AMV在反應(yīng)體系中的使用濃度為0.24U/μl，則該濃度定義為1×，那么在試劑盒中的濃度如果為10×，其實(shí)際濃度為2.4U/μl；再如，如果Tris在反應(yīng)體系中的使用濃度為40mM，則該濃度定義為1×，那么在試劑盒中的濃度如果為25×，其實(shí)際濃度為1M。