[發明專利]一種發酵液中木聚糖酶的快速測定方法

在審

• 申請號: 201410154007.9
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN103900981A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 曹陽春;姚軍虎;王臘梅;魏筱詩;李宗軍;孫菲菲;劉凱;曹志昂;王衛濤;李飛
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種發酵液中木聚糖酶的快速測定方法，屬于生物技術領域。

背景技術

木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物半纖維素的重要組分，它占植物碳水化合物總量的三分之一，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的再生生物質資源。雖然木聚糖是一類廣泛存在于植物體內的半纖維素，但是，由于木聚糖在動物消化道內不能被消化吸收，同時提高食糜的黏稠度，阻礙營養物質，尤其是脂肪和蛋白質的消化吸收，并且降低飼料的轉化率，具有很強的抗營養特性，因而限制了許多飼料的應用。木聚糖酶可將木聚糖逐次降解為低聚木糖及木糖，從而消除木聚糖的抗營養作用，提高動物對飼料的利用率，降低胃腸道食糜的粘性，減少畜禽腸道疾病，增進畜禽健康，提高畜禽成活率，減少粘糞，降低空氣中氨氣和硫化物濃度，減少環境污染，使畜禽體重均勻。同時，木聚糖酶的應用也為緩解能量飼料資源的短缺、開辟非常規飼料資源提供了新的途徑。因此，木聚糖酶在飼料資源開發和提高廉價副產品的利用率方面，具有廣闊的前景。

測定木聚糖酶活力的方法主要有以下3種：黏度法、底物染色法和還原糖法。黏度法是通過測定木聚糖酶對底物黏度的降解速度來計算酶活力，這種測定分析方法有較好的實用價值，但是測定過程比較繁瑣，而且重復性較差，目前很少采用。底物染色法是一種比較簡便快速的測定方法，其基本原理是以木聚糖為基質，用膠聯方式連接和包裹特定的染料，制成染料含量均衡，質量穩定的片劑。這種片劑容易溶于水溶液中，與木聚糖酶反應后，長鏈木聚糖被降解，結合的染料分子被釋放到溶液中，通過測定溶液中染料濃度就可以就算出酶活。這種測定方法經常被一些檢測分析專業生產生物酶的大型企業采用，但是，它只能測定特定的木聚糖酶活力，不具有代表性。還原糖法是通過測定還原糖產量來計算酶活。這種分析方法比較簡便，而且重復性也比較好。國內外關于木聚糖酶的研究報告多數采用這種方法，它的不足是測定速度較慢，分光光度計每次僅能分析一個樣品。

發明內容

現有木聚糖酶測定方法費時費力，一次僅能檢測一個樣品，所以人為誤差較大。本發明的目的在于克服現有技術的缺點和不足，優化木聚糖酶檢測方法，建立新的反應體系，每個反應可同時最大檢測96個樣品，大大提高了木聚糖酶檢測速度，同時降低人為測定誤差。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。

一種發酵液中木聚糖酶的快速測定方法，具體方法為：將發酵液在1000×g離心10min，取上清液測定木聚糖酶活性，將適當稀釋的上清液、10g/L木聚糖溶液和50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)置于39℃預熱15-30min，然后向75μL適當稀釋的上清液中加入75μL磷酸鈉緩沖液和50μL木聚糖溶液，39℃反應15-30min后，加入300μL的DNS溶液終止反應。沸水浴5min后，冷卻至室溫。取200-300μL于干燥潔凈的96孔酶標板上，用全自動酶標儀在530-550nm下檢測吸光值，根據木糖的標準曲線計算木聚糖酶活性。

進一步地，所述10g/L木聚糖溶液的配制方法為：準確稱取10g木聚糖標準品溶于800mL去離子水中，然后定容至1L。

進一步地，所述50mM磷酸鈉緩沖溶液為pH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，配制方法為：200mM磷酸氫二鈉溶液，稱取28.396g磷酸氫二鈉，用去離子水充分溶解，并定容至1L；200mM磷酸二氫鈉溶液，稱取23.996g磷酸二氫鈉，用去離子水充分溶解，并定容至1L；將200mM磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液分別用去離子水稀釋至50mM，所述磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶液的使用比例為61∶39。

進一步地，所述DNS溶液的配制方法為：將10g的3,5-二硝基水楊酸溶于800mL去離子水中，然后依次加入10g氫氧化鈉、208g酒石酸鉀鈉、2.0g苯酚和0.5g亞硫酸氫鈉，溶解并攪拌均勻后，定容至1L。

進一步地，所述DNS溶液需要置于棕色瓶中避光保存。

進一步地，木聚糖酶的1個酶活力單位(U)可被定義為在上述酶促反應條件下，1mL檢測發酵液在1min內自標準底物木聚糖中釋放1μmol木糖所需的酶量。

該發明的有益效果在于：本發明技術修訂了發酵液中木聚糖酶的測定方法，可快速大量且準確的測定木聚糖酶活性，減少人為誤差。同時，較少的樣品量即可檢測。

附圖說明

圖1本發明實施例中所測定的木聚糖酶活性標準曲線。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的具體實施方式進行描述，以便更好的理解本發明。

實施例