[發明專利]一種新疆雪蓮愈傷組織超低溫保存的方法

有效

• 申請號: 201410152693.6
• 申請日: 2014-04-16
• 公開（公告）號: CN103975852A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 郭斌;尉亞輝;何瑋;祁昊楠
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及植物愈傷組織的保存，具體涉及一種新疆雪蓮（Saussurea?involucrata?Kar.et?Kir.）愈傷組織超低溫保存的方法，通過低大氣壓力對新疆雪蓮愈傷組織進行預處理，明顯提高于愈傷組織超低溫保存后組織的復活率，為新疆雪蓮種質保存提供技術依據。?

背景技術

新疆雪蓮屬菊科（Compositae）菜薊族（Trib.Cynareae?Less.）鳳毛菊屬（Saussurea?sp.）多年生草本植物，是一種名貴的高原藥用植物。新疆雪蓮具有散寒除濕、強筋助陽、抗炎鎮痛、收縮子宮等功能，可治療婦女小腹冷痛、陽痿、抗衰老及抑制癌細胞增生等作用。?

新疆雪蓮主要分布在海拔2400～4100m的高山冰漬石、流石灘石隙及高山草甸懸崖峭壁上，其生境的土壤極為貧瘠，再加上惡劣的高原環境，其生長速度緩慢，從種子發芽到開花結籽需3至5年時間。因此，野生的新疆雪蓮資源非常有限，再加上近年來對雪蓮的大規模、無計劃的采挖，更是造成了該植物資源的急劇減少。1988年新疆雪蓮的資源總量還有2830多萬株，而現在可采集量僅為300萬株，在《中國珍稀瀕危保護植物名錄》中，已被列為國家三級漸危物種。另一方面，對野生新疆雪蓮的采挖必然造成周圍環境和其它植被的破壞。因此，很有必要對現有的原生長地新疆雪蓮進行種質資源保護。?

常規的植物種質資源保存以田間種植、室內貯藏等形式為主,其需要大量的人力和物力等,這使其廣泛應用于種質資源的保存受到了限制。近年來,在離體培養技術基礎上發展起來的超低溫保存技術,以其無菌培養、保存穩?定、占用空間少等優點在植物種質資源的長期保存中受到了人們的重視,得到了廣泛的應用。?

發明內容

本發明的目的在于，提供一種新疆雪蓮愈傷組織超低溫保存的方法。?

為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案：?

一種新疆雪蓮愈傷組織超低溫保存的方法，其特征在于，按以下步驟進行：?

步驟一，新疆雪蓮愈傷組織的獲得：?

取新疆雪蓮種子，用濃度為0.1%的升汞進行表面滅菌，再轉接到MS培養基上進行萌發；將萌發后長出的子葉作為外植體，切割成0.3cm²大小，然后接到含a-萘乙酸：2.5mg/L和6-芐氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培養基上進行培養，培養溫度25℃±2℃，光照強度為3000Lux、光周期16小時；培養35天后獲得新疆雪蓮愈傷組織；?

步驟二，新疆雪蓮愈傷組織的繼代：?

將步驟一誘導出的新疆雪蓮愈傷組織轉接到含有a-萘乙酸：2.5mg/L、6-芐氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培養基上進行培養，培養基中蔗糖濃度調節到4%-6%，培養溫度25℃±2℃，光照強度為4000Lux，光周期16小時；培養25天后可用于低大氣壓力預培養；?

步驟三，新疆雪蓮愈傷組織的低大氣壓力預培養：?

將培養25天的新疆雪蓮愈傷組織轉移到40-60kP的容器中培養4-8天，然后直接作為超低溫保存的材料：?

步驟四，新疆雪蓮愈傷組織的超低溫保存：?

將經過低大氣壓力預培養的新疆雪蓮愈傷組織在室溫下無菌轉移到60%的玻璃化溶液（含有30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖）中處理30分鐘，再在0℃下無菌轉移到100%的玻璃化溶液中處理45?分鐘，再用100%的玻璃化溶液洗滌，然后裝入冷凍管并立即投入液氮中保存。?

步驟五，超低溫凍存新疆雪蓮愈傷組織的解凍和再培養：?

從液氮中取出裝有新疆雪蓮愈傷組織的凍存管立即投入37℃溫水中解凍3分鐘，然后將解凍的愈傷組織在室溫下用MS液體培養基洗滌3次，洗滌時間為每次3分鐘。將洗滌后的愈傷組織轉接到含有a-萘乙酸：2.5mg/L、6-芐氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培養基上培養，開始5天為暗培養，然后轉移到光照下培養，培養溫度25℃±2℃，光照強度為4000Lux、光周期16小時。總共培養40天后，在凍存愈傷組織的表面形成新的愈傷組織。?

根據本發明，所述的步驟二中繼代培養基中蔗糖的最佳濃度為4%；步驟三中新疆雪蓮愈傷組織低壓處理培養容器的最佳的壓力值是50kP、最佳處理時間為6天。在此條件下，凍存的新疆雪蓮愈傷組織解凍后培養40天其復活率可達到75%，是對照的3.3倍（沒有經過低大氣壓力預培養的材料）。?