[發明專利]一種新疆雪蓮愈傷組織超低溫保存的方法

有效

• 申請號: 201410152693.6
• 申請日: 2014-04-16
• 公開（公告）號: CN103975852A
• 公開（公告）日: 2014-08-13
• 發明（設計）人: 郭斌;尉亞輝;何瑋;祁昊楠
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01N3/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種新疆雪蓮愈傷組織超低溫保存的方法，其特征在于，按以下步驟進行：

步驟一，新疆雪蓮愈傷組織的獲得：

取新疆雪蓮種子，用濃度為0.1%的升汞進行表面滅菌，再轉接到MS培養基上進行萌發；將萌發后長出的子葉作為外植體，切割成0.3cm²大小，然后接到含2.5mg/L?a-萘乙酸和0.5mg/L6-芐氨基腺嘌呤的MS培養基上進行培養，培養溫度25℃±2℃，光照強度為3000Lux，光周期16小時；培養35天后獲得新疆雪蓮愈傷組織；

步驟二，新疆雪蓮愈傷組織的繼代：

將步驟一誘導出的新疆雪蓮愈傷組織轉接到含有a-萘乙酸：2.5mg/L、6-芐氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培養基上進行培養，培養溫度25℃±2℃，光照強度為4000Lux，光周期16小時；培養25天后可用于低大氣壓力預培養；

步驟三，新疆雪蓮愈傷組織的低大氣壓力預培養：

將培養25天的新疆雪蓮愈傷組織轉移到低大氣壓力下培養預培養4-8天，然后直接作為超低溫保存的材料；

步驟四，新疆雪蓮愈傷組織的超低溫保存：

將經過低大氣壓力預培養的新疆雪蓮愈傷組織在室溫下無菌轉移到60%的玻璃化溶液中處理30分鐘，再在0℃下無菌轉移到濃度為100%的玻璃化溶液中處理45分鐘，再用100%的玻璃化溶液洗滌，然后裝入冷凍管并投入液氮中保存；

步驟五，超低溫凍存新疆雪蓮愈傷組織的解凍和再培養：

從液氮中取出裝有新疆雪蓮愈傷組織的凍存管立即投入37℃溫水中解凍3分鐘，然后將解凍的愈傷組織在室溫下用MS液體培養基洗滌3次，洗滌時間為每次3分鐘，將洗滌后的愈傷組織轉接到含有a-萘乙酸：2.5mg/L、6-芐氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培養基上培養，開始5天為暗培養，然后轉移到光照下培養，培養溫度25℃±2℃，光照強度為4000Lux，光周期16小時，總共培養40天后，在凍存愈傷組織的表面形成新的愈傷組織。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟二中所述的用于新疆雪蓮愈傷組織繼代的培養基中的蔗糖濃度調節至4%-6%。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟三中所述的低大氣壓力是指培養容器的大氣壓力值為40-60kP。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟四中所述的60%的玻璃化溶液的組成是：30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟五中所述的凍存材料經過解凍后培養40天，在其表面形成新的愈傷組織，此時，凍存材料的復活率=能夠形成新愈傷組織的凍存愈傷組織塊個數/凍存愈傷組織塊的總個數×100%。