[發(fā)明專利]基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測(cè)方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410149222.X
• 申請(qǐng)日: 2014-04-14
• 公開（公告）號(hào): CN103911454A
• 公開（公告）日: 2014-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于聰;王燕;陳健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/48;C12Q1/44
• 代理公司: 長(zhǎng)春菁華專利商標(biāo)代理事務(wù)所 22210
• 代理人: 陶尊新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測(cè)方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法。?

背景技術(shù)

激基締合物（excimer）是指兩個(gè)同種分子和原子的聚集體，在激發(fā)態(tài)時(shí)兩個(gè)分子或原子的作用較強(qiáng)，產(chǎn)生新的能級(jí)，發(fā)射光譜不同于單個(gè)物種，無精細(xì)結(jié)構(gòu)。而在基態(tài)時(shí)作用較弱或無作用。激基締合物（excimer）熒光具有其較大的stokes位移和較長(zhǎng)的熒光壽命，在生物分析和傳感中已經(jīng)有不少應(yīng)用。許多具有平面芳環(huán)結(jié)構(gòu)的分子都具有激基締合物熒光。苝衍生物是一類稠環(huán)共軛化合物，它有大的π-π共軛電子結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)良的熒光量子效率和光，熱穩(wěn)定性。通過化學(xué)修飾，可以使它帶上一個(gè)親水的基團(tuán)R，它可以為帶負(fù)電荷的磺酸基團(tuán)，羧酸基團(tuán)，或是帶正電荷的季銨鹽。?

現(xiàn)目前，越來越多的人體疾病被發(fā)現(xiàn)與異常的DNA甲基化有關(guān)系，在S-腺苷甲硫氨酸（SAM）存在的情況下，DNA甲基化酶能夠催化DNA的甲基化過程。因此，對(duì)DNA甲基化酶活性及其抑制劑的篩選對(duì)于基礎(chǔ)的生物學(xué)研究，藥物發(fā)現(xiàn)，基因疾病診斷治療具有重要的意義。?

許多傳統(tǒng)的方法如電泳，高效液相色譜，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等已經(jīng)被用作甲基化酶活性的檢測(cè)。近些年來，越來越多的基于電化學(xué)，比色，熒光的方法已經(jīng)被報(bào)道。如2007年TanWeihong等人設(shè)計(jì)了一種帶有5’-G-A-T-C-3’識(shí)別位點(diǎn)的分子信標(biāo)，用來檢測(cè)甲基化酶（Anal.Chem.2007,79,1050–1056）。分子信標(biāo)的5’端和3’端分別修飾了熒光集團(tuán)和猝滅集團(tuán)。在甲基化酶和限制性內(nèi)切酶的存在下，Dam甲基化酶可以催化5’-G-A-T-C-3’序列中的A堿基甲基化，限制性內(nèi)切酶切割了5’-G-Am-T-C-3’序列，導(dǎo)致分子信標(biāo)的熒光恢復(fù)。然而由于熒光集團(tuán)和猝滅集團(tuán)的修飾，使得方法有過程繁瑣，耗時(shí)，?且成本高等缺陷。2011年，一種利用氧化石墨烯猝滅熒光的性質(zhì)來檢測(cè)甲基化酶的方法被報(bào)道（Anal.Chem.2011,83,8906–8912），該方法設(shè)計(jì)了作為酶切底物的DNA（圖3）,其中單鏈的部分是用來與氧化石墨烯結(jié)合的，雙鏈的部分帶有甲基化酶和限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。同時(shí)在雙鏈的末端修飾了熒光集團(tuán)，由于單鏈與石墨烯結(jié)合，石墨烯能夠猝滅熒光集團(tuán)的熒光，當(dāng)有限制性內(nèi)切酶存在時(shí)，識(shí)別位點(diǎn)被切割，熒光恢復(fù)。但是，當(dāng)甲基化酶和限制性內(nèi)切酶同時(shí)存在時(shí)，甲基化酶催化識(shí)別位點(diǎn)甲基化，識(shí)別位點(diǎn)序列被甲基化后阻礙了內(nèi)切酶的切割，此時(shí)，熒光不能恢復(fù)。此方法也有一些不足之處，首先納米材料的制備過程同樣繁瑣且成本高，需要耗費(fèi)相當(dāng)?shù)臅r(shí)間和資金；其次熒光集團(tuán)的共價(jià)修飾也是過程繁瑣成本高；另外給出的是淬滅的熒光信號(hào)，相比于熒光增強(qiáng)更容易受到干擾信號(hào)的影響。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的甲基化酶活性的檢測(cè)方法和甲基化酶抑制劑的篩選方法耗時(shí)、成本高且靈敏度低的問題，而提供一種基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測(cè)方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法。?

本發(fā)明首先提供一種基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測(cè)方法，包括如下：?

步驟一：制備雙鏈DNA；?

步驟二：將步驟一得到的雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內(nèi)切酶和不同濃度的甲基化酶反應(yīng)，得到混合溶液；?

步驟三：將末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)緩沖液與步驟二得到的混合溶液反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；?

步驟四：將苝衍生物探針與聚陽(yáng)離子的混合溶液和步驟三得到的反應(yīng)溶液反應(yīng)，對(duì)甲基化酶的活性進(jìn)行熒光檢測(cè)。?

優(yōu)選的是，所述的甲基化酶為Dam、HpaII或M.SssI。?

優(yōu)選的是，所述的甲基化酶的濃度范圍為0-80U/mL。?

優(yōu)選的是，所述的步驟四中的聚陽(yáng)離子的結(jié)構(gòu)式為：?

優(yōu)選的是，所述的步驟四的反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為5min。?

本發(fā)明還提供一種基于苝激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，包括如下：?

步驟一：制備雙鏈DNA；?

步驟二：將步驟一得到的雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內(nèi)切酶、甲基化酶和不同濃度的甲基化酶抑制劑反應(yīng)，得到混合溶液；?

步驟三：將末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)緩沖液與步驟二得到的混合溶液反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；?