[發明專利]基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法及其甲基化酶抑制劑的篩選方法有效
| 申請號： | 201410149222.X | 申請日： | 2014-04-14 |
| 公開（公告）號： | CN103911454A | 公開（公告）日： | 2014-07-09 |
| 發明（設計）人： | 于聰;王燕;陳健 | 申請（專利權）人： | 中國科學院長春應用化學研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12Q1/48;C12Q1/44 |
| 代理公司： | 長春菁華專利商標代理事務所 22210 | 代理人： | 陶尊新 |
| 地址： | 130022 吉林*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 苝激基 締合 甲基化酶 活性 檢測 方法 及其 抑制劑 篩選 | ||
1.一種基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，包括如下：
步驟一：制備雙鏈DNA；
步驟二：將步驟一得到的雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內切酶和不同濃度的甲基化酶反應，得到混合溶液；
步驟三：將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和末端脫氧核苷酸轉移酶反應緩沖液與步驟二得到的混合溶液反應，得到反應溶液；
步驟四：將苝衍生物探針與聚陽離子的混合溶液和步驟三得到的反應溶液反應，對甲基化酶的活性進行熒光檢測。
2.根據權利要求1所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的甲基化酶為Dam、HpaII或M.SssI。
3.根據權利要求1所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的甲基化酶的濃度范圍為0-80U/mL。
4.根據權利要求1所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的步驟四中的聚陽離子的結構式為：
5.根據權利要求1所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶活性的檢測方法，其特征在于，所述的步驟四的反應溫度為37℃，反應時間為5min。
6.一種基于苝激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，包括如下：
步驟一：制備雙鏈DNA；
步驟二：將步驟一得到的雙鏈DNA與S-腺苷甲硫氨酸、限制性內切酶、甲基化酶和不同濃度的甲基化酶抑制劑反應，得到混合溶液；
步驟三：將末端脫氧核苷酸轉移酶、脫氧核糖核苷三磷酸和末端脫氧核苷酸轉移酶反應緩沖液與步驟二得到的混合溶液反應，得到反應溶液；
步驟四：將苝衍生物探針與聚陽離子的混合溶液和步驟三得到的反應溶液反應，對甲基化酶抑制劑用熒光方法進行篩選。
7.根據權利要求6所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的甲基化酶抑制劑為慶大霉素、5-氟尿嘧啶、卞青霉素或絲裂霉素。
8.根據權利要求6所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的甲基化酶抑制劑的濃度范圍為0-1μM。
9.根據權利要求6所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的步驟四中的聚陽離子的結構式為：
10.根據權利要求6所述的一種基于苝激基締合物的甲基化酶抑制劑的篩選方法，其特征在于，所述的步驟四的反應溫度為37℃，反應時間為5min。
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