[發明專利]一種具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410148999.4
• 申請日: 2014-04-14
• 公開（公告）號: CN103881994B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 張偉;張宇宏;劉波;孫寧;張佳琳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 北京市萬慧達律師事務所 11111
• 代理人: 楊穎;張金芝

本發明屬于基因工程和遺傳工程領域，公開了一種具有高轉糖苷活性的β?半乳糖苷酶突變體，其是在去除了自身信號肽的亮白曲霉和米曲霉的β?半乳糖苷酶的氨基酸序列的基礎上，通過單位點的定點飽和突變所獲得的，該突變體的轉糖苷活性比野生型提高15%以上。同時，本發明還公開了編碼上述突變體的DNA分子、含有上述DNA分子的重組表達載體以及表達上述DNA分子的宿主細胞。此外，本發明還提供了采用上述重組表達載體制備具有高轉糖苷活性的β?半乳糖苷酶的方法以及上述突變體、DNA分子、重組表達載體和宿主細胞在制備β?半乳糖苷酶中的應用。

技術領域

本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體涉及一種具有高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術

低聚半乳糖(GOS)是一類在人體胃腸道內不能被消化吸收而直接進入大腸被各種雙歧桿菌良好利用的具有特殊生物學功能的低聚糖。它能夠改善人體內微生態環境，有利于雙歧桿菌和其它有益菌的增殖，提高人體免疫功能。同時，GOS經代謝產生有機酸使腸內pH值降低，抑制腸內沙門氏菌和腐敗菌的生長，減少有毒發酵產物及有害細菌酶的產生，調節胃腸功能，減輕了肝臟分解毒素的負擔。由于低聚半乳糖有著比其他功能性低聚糖更優良的性質，從而使低聚半乳糖作為添加劑大規模應用更方便易行，能夠適應更多的食品種類和更廣的消費群體，有巨大的應用價值和市場潛力。

GOS制備方法通常有五種：從天然原料中提取、天然多糖的酸水解、化學法合成、發酵法及酶法合成。由于GOS在自然界中含量低，無色不帶電荷故難以提取分離；天然多糖轉化產品得率低，產物成分復雜，難以純化；化學法毒性大易殘留，對環境污染重；發酵法生產GOS的研究很少，仍處于實驗室規模，無法進行大量生產。目前低聚半乳糖的工業化生產是通過β-半乳糖苷酶完成的。β-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galatohydrolase，EC3.2.1.23)又稱乳糖酶(Lactase)，具有水解和轉糖苷的雙重作用。早先對于β-半乳糖苷酶的研究主要集中在利用其水解功能生產低乳糖乳制品，來解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的腹瀉、腹脹等多種不良反應。隨著低聚半乳糖特殊的保健功能的確定，利用β-半乳糖苷酶的轉糖苷作用生產低聚半乳糖成為研究熱點。主要集中在以下三個方面：

1、篩選高轉糖苷活性的β-半乳糖苷酶產生菌

酵母、芽孢桿菌、曲霉、青霉、雙歧桿菌等多種微生物中都有具轉糖苷酶 活性的β-半乳糖苷酶。研究表明，不同來源的β-半乳糖苷酶因其酶學性質各異，合成低聚半乳糖時的反應條件大不相同。β-半乳糖苷酶根據最適pH可分為酸性和中性兩種。通常霉菌來源的β-半乳糖苷酶為酸性酶，其作用最適pH在pH2.5～5.5，最適反應溫度較高(50～60℃)；酵母和細菌所產的β-半乳糖苷酶為中性酶，其最適pH介于pH6～7.5，最適反應溫度較低(30～40℃)。不同來源的β-半乳糖苷酶作用的底物類型也不盡相同，由此生成的低聚半乳糖中寡糖的種類和比例也千差萬別，這就使低聚半乳糖家族的新成員層出不窮。盡管如此，篩選到的天然β-半乳糖苷酶的轉糖苷活性普遍較低，低聚半乳糖的最高產率通常只有5～30％，無法滿足工業化生產的要求。

2、優化反應條件、改進生產工藝