[發明專利]利用DNA穩定性同位素探針原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法

無效

• 申請號: 201410148322.0
• 申請日: 2014-04-04
• 公開（公告）號: CN103966318A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 馮有智;林先貴;賈仲君
• 申請（專利權）人: 中國科學院南京土壤研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐循文

技術領域

本發明涉及一種利用DNA穩定性同位素探針（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法，屬于土壤微生物生態學領域。

背景技術

全球稻田面積約1.5億公頃，75%處于淹水狀態。厭氧環境使得水稻土含有豐富的小分子有機酸。通過代謝這些物質，微生物驅動著稻田生態系統的生物地球化學循環過程。甲酸是稻田有機質降解過程中重要中間產物之一，在水稻土中的濃度可以高達150 μM。水稻土中多種微生物可以代謝甲酸，如Clostridia綱內多種厭氧細菌可利用甲酸為電子供體執行硫酸鹽還原和鐵還原過程。同時，甲酸也是稻田甲烷排放的重要前體：每年稻田甲烷排放量占每年全球甲烷排放量的4-9%，約25-54 Tg，其中甲酸和H₂/CO₂產生的甲烷量合占稻田甲烷排放量的10-30%。鑒于甲酸是稻田甲烷排放的重要前提，以及甲酸在水稻土中的高含量，我們推測水稻土中一定存在能夠直接代謝甲酸的產甲烷古菌。然而，水稻土中甲酸利用型產甲烷古菌卻尚未見報道。其原因第一，目前可培養的微生物只占全部微生物的1%，大量微生物只能在特定的生境中存活和執行生態功能，還無法純培養；第二、產甲烷古菌是嚴格厭氧微生物，其對生長環境的要求很高，傳統方法很難篩選到；第三、雖然在純培養條件下部分產甲烷古菌能夠利用甲酸生長，但是純培養條件不能代表水稻土中的原位生境，所以獲得的菌株不能反映水稻土中的真實情況。近年發展起來的DNA穩定性同位素探針技術（DNA-based Stable Isotope Probing）為我們的原位鑒定提供了可能。

DNA穩定性同位素探針技術結合實時定量PCR和指紋圖譜等分子生物學方法，能夠定向發掘復雜土壤環境中參與特定生態過程的微生物資源，是當前土壤功能微生物原位鑒定較為有效的手段之一。DNA穩定性同位素探針技術基本原理是在土壤中添加含有穩定性同位素標記的代謝底物，當特定土壤微生物利用該標記底物生長繁殖，就會同化代謝底物上含標記的元素，并用于合成其生物質，如DNA等。因此，通過對環境DNA進行提取分離鑒定和比對分析，即可鑒別出土壤中驅動特定生態過程的功能微生物。該方法能夠準確揭示執行特定功能的微生物，已成為原位鑒定功能微生物的重要手段之一。鑒于稻田甲酸和產甲烷古菌在生物地球化學循環過程中的重要性，該技術在水稻土中甲酸利用型產甲烷古菌鑒定上的應用，將有助于擴大我們對微生物所驅動的稻田養分循環過程和稻田產甲烷古菌功能群的生態功能的認知。

發明內容

解決的技術問題：本發明所要解決的技術問題在于提供一種DNA穩定性同位素探針（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法，以填補相關的理論空白，對于了解微生物驅動的稻田養分循環過程和稻田產甲烷古菌功能群的生態功能認知都有重大的貢獻。

技術方案：本發明所述的一種利用DNA穩定性同位素探針（DNA-based Stable Isotope Probing）原位揭示判別稻田甲酸利用型產甲烷古菌的方法，其工藝流程如圖1所示，具體包括以下步驟：

（1）采集水稻土樣品；

（2）進行¹³C-甲酸的微宇宙培育實驗；

（3）利用超高速離心機對¹³C-甲酸培育的土壤微生物總DNA進行離心分層；

（4）對分層后多個浮力密度中的產甲烷古菌基因進行實時定量PCR分析和指紋圖譜分析，最終確定該水稻土中具有代謝活性的甲酸利用型產甲烷古菌。

所述的微宇宙培育實驗的步驟為：將100 mg ¹³C-甲酸加入到裝有5克干土重的120 mL玻璃瓶中，用無菌去離子水調至田間土壤最大持水重量的60%，并用氮氣置換玻璃瓶中空氣后用橡膠塞密封，以保持培養體系的厭氧環境；同時以¹²C-甲酸和不加甲酸的處理為分別為對照，放置28℃培養箱恒溫培養，每隔3天抽出1.2 mL上層空氣，利用氣相色譜儀測定甲烷氣體濃度變化，待甲烷濃度開始降低停止培育實驗。